Для работы необходимо иметь чистые и обезжиренные предметные и покровные стекла. Новые стекла кипятят 15-20 мин в 2-5% растворе соды или мыльной воде, споласкивают водой и помещают в слабую хлороводородную кислоту, затем тщательно промывают водой.
Стекла, бывшие в употреблении и загрязненные красителями или иммерсионным маслом, можно обработать двумя способами: 1) погрузить на 2 ч в концентрированную серную кислоту или хромовую смесь, а затем тщательно промыть; 2) кипятить 30-40 мин в 5% растворе соды или щелочи. Необработанные стекла можно обезжирить, натерев их мылом, а затем очистить от него сухой тканью.
Внимание! Если стекло хорошо обезжирено, то капля воды растекается на нем равномерно, не распадаясь на мелкие капли.
Хранят стекла в сосудах с притертыми пробками в смеси Никифорова (равные объемы спирта и эфира) или в 96% спирте. Из растворов стекла извлекают пинцетом.
Внимание! При работе стекла держат пальцами за грани.
Материал для исследования наносят на предметное стекло бактериальной петлей, иглой или пастеровской пипеткой. Чаще всего применяют бактериальную петлю (рис. 7), сделанную из платиновой или нихромовой нити длиной 5-6 см. Петлю закрепляют в петледержателе или впаивают в стеклянную палочку. Конец проволоки сгибают в виде кольца размером 1×1,5 или 2×3 мкм.
Рис. 7. Игла и петли для посева. 1 — игла; бактериальные петли: 2, 3 — петли приготовлены неправильно; 4 — петля приготовлена правильно
Внимание! Правильно приготовленная петля при погружении в воду и извлечении оттуда сохраняет водную пленку.
Перед приготовлением мазка рабочую часть петли прожигают в пламени горелки в вертикальном положении: сначала саму петлю, а затем металлический стержень. Эту манипуляцию проводят и после окончания посева.
Приготовление мазка из культуры, выращенной на жидкой питательной среде. Обезжиренное предметное стекло прожигают в пламени горелки и охлаждают. На предметное стекло, помещенное на подставку (чашку Петри, штатив), наносят культуру. Пробирку с культурой держат большим и указательным пальцами левой руки. Петлю держат в правой руке. Не выпуская петли, мизинцем правой руки прижимают пробку к ладони и осторожно вынимают ее из пробирки. Движения должны быть плавными и спокойными. Горло пробирки обжигают в пламени горелки. Вводят петлю в пробирку. Охлаждают петлю о стенку пробирки и затем погружают ее в культуру. Вынимают петлю, не касаясь ею стенок пробирки. Закрывают пробку, предварительно проведя ее через пламя горелки. Ставят пробирку в штатив. Петлей наносят культуру на предметное стекло, круговыми движениями равномерно распределяя ее. Затем петлю прожигают в пламени горелки. Мазок оставляют для высыхания.
Внимание! Мазок должен быть равномерно растертым, тонким и небольшим (с двухкопеечную монету).
Приготовление мазка из культуры, выращенной на плотной питательной среде. На подготовленное предметное стекло наносят пастеровской пипеткой или петлей каплю изотонического раствора натрия хлорида (0,9%). Культуру осторожно снимают петлей с агара в пробирке или чашке Петри и эмульгируют в капле на стекле. Приготовленный мазок должен быть равномерным и не густым. При его высыхании на предметном стекле остается слабый налет.
Приготовление мазка из гноя или мокроты. Материал забирают стерильной пипеткой или петлей и наносят на середину предметного стекла. Вторым предметным стеклом покрывают первое так, чтобы свободными остались треть первого и второго стекол. Стекла с усилием раздвигают в стороны. Получают два больших мазка.
Приготовление мазка из крови. Каплю крови наносят на предметное стекло на расстоянии одной трети от левого края. Затем краем специально отшлифованного стекла, наклонив его под углом 45°, прикасаются к капле крови. Прижимая отшлифованное стекло к предметному продвигают его вперед. Правильно приготовленный мазок имеет желтоватый цвет и просвечивает.
Приготовление мазков-отпечатков из внутренних органов трупов и пищевых продуктов твердой консистенции. Поверхность органа или пищевого продукта прижигают раскаленным скальпелем и из этого участка вырезают кусочек материала. Пинцетом осторожно захватывают этот кусочек и поверхностью среза прикасаются к предметному стеклу в двух — трех местах, делая ряд мазков-отпечатков.
Высушивание мазка
Мазок высушивают на воздухе при комнатной температуре. В случае необходимости его можно высушить около пламени горелки, держа стекло в горизонтальном положении за края большим и указательным пальцами мазком вверх.
Внимание! При высокой температуре может произойти нарушение структуры клеток.
Фиксация мазка
Мазки фиксируют после полного высыхания с целью: 1) закрепить микроорганизмы на стекле; 2) обезвредить материал; 3) убитые микроорганизмы лучше воспринимают окраску. Фиксированный мазок называется препаратом.
Способы фиксации. 1. Физический — в пламени горелки: стекло берут пинцетом или большим и указательным пальцами и троекратно проводят через верхнюю часть пламени горелки в течение 6 с.
2. Химический — в жидкости: клеточные элементы в мазках из крови и мазках-отпечатках при действии высоких температур разрушаются, поэтому их обрабатывают одной из фиксирующих жидкостей: а) метиловым спиртом- 5 мин; б) этиловым спиртом — 10 мин; в) смесью Никифорова — 10-15 мин; г) ацетоном — 5 мин; д) парами кислоты и формалина — несколько секунд.
Окраска препаратов
После фиксации приступают к окраске препарата.
Окраску препаратов производят на специально оборудованном столе, покрытом линолеумом, пластиком, стеклом и т. д. На столе необходимы сосуд с дистиллированной водой; подставка из двух трубочек или палочек, соединенных резиновыми трубками с обеих сторон (для размещения препаратов); пинцеты, цилиндры, пипетки, фильтровальная бумага, набор красителей, емкость для их слива. Стол для окраски должен находиться рядом с водопроводным краном.
Отношение микроорганизмов к красителям называется их тинкториальными свойствами. В микробиологии широко используют анилиновые красители. Большинство микроорганизмов лучше воспринимает основные красители.
Наиболее употребительны следующие красители: красные (фуксин основной, фуксин кислый, конго красный, нейтральный красный); синие (метиленовый и толуидиновый); фиолетовые (генциановый, метиловый, кристаллический); коричнево-желтые (везувин, хризоидин); зеленые (бриллиантовый, малахитовый).
Все красители выпускают в виде аморфных или кристаллических порошков. Из них готовят насыщенные спиртовые и феноловые растворы, а затем для работы используют водно-спиртовые или водно-феноловые растворы красителей. Если при окраске используют концентрированные растворы красителей, то препарат предварительно накрывают фильтровальной бумагой, на которую наносят краситель. При этом кусочки красителя остаются на бумаге.
Внимание! Каплю красителя наносят пипеткой так, чтобы он покрыл весь препарат.
Рецепты красителей
1. Насыщенные спиртовые растворы (исходные):
красителя — 1 г спирта 96% — 10 мл
Смесь помещают в термостат до полного растворения на несколько дней. Взбалтывают ежедневно. Хранят в склянках с притертыми пробками.
2. Карболовый фуксин Циля (для окраски кислотоустойчивых микроорганизмов, спор и капсул):
насыщенного спиртового раствора основного фуксина — 10 мл раствора карболовой кислоты 5% — 90 мл
Внимание! Карболовую кислоту вливают в краситель, а не наоборот.
Смесь в течение нескольких минут энергично встряхивают, фильтруют и сливают во флакон для хранения.
3. Фуксин Пфейффера (для окраски по Граму и для простого метода окраски):
Фуксина Циля — 1 мл воды дистиллированной — 9 мл
Краситель готовят непосредственно перед применением.
4. Карболовый генциановый фиолетовый (для окраски по Граму):
насыщенного спиртового раствора
генцианового фиолетового — 10 мл
карболовой кислоты 5% — 100 мл
Растворы смешивают и фильтруют через бумажный фильтр.
5. Раствор Люголя (для окраски по Граму и реактив на крахмал):
йодида калия — 2 г кристаллического йода — 1 г дистиллированной воды — 10 мл
Смесь помещают в бутыль матового стекла, хорошо закупоривают и ставят на сутки в термостат, затем добавляют 300 мл дистиллированной воды.
6. Щелочной раствор метиленового синего Леффлера:
насыщенного спиртового раствора метиленового синего — 30 мл раствора гидроксида калия 1% — 1 мл дистиллированной воды — 100 мл
7. Бумажки по Синеву (для окраски по Граму):
1% спиртовой раствор кристаллического фиолетового
Полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором и высушивают.
Методы окраски делят на ориентировочные (простые) и дифференциальные (сложные), выявляющие химические и структурные особенности бактериальной клетки.
Простой метод окраски
Препарат помещают на подставку для окраски, исследуемым материалом вверх. Пипеткой наносят на него раствор красителя. По истечении указанного времени краситель осторожно сливают, препарат промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой. При простом методе используют один краситель. Метиленовым синим и щелочным синим Леффлера окрашивают препарат в течение 3-5 мин, фуксином Пфейффера — 1-2 мин (см. рис. 4).
На окрашенный и высушенный препарат наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют с помощью иммерсионной системы.
Сложные методы окраски
Окраска по Граму (универсальный метод). Наиболее распространенным методом дифференциальной окраски является окраска по Граму.
В зависимости от результатов окраски все микроорганизмы делят на две группы — грамположительные и грамотрицательные.
Грамположительные бактерии содержат в клеточной стенке магниевую соль РНК, которая образует комплексное соединение с йодом и основным красителем (генциановым, метиловым или кристаллическим фиолетовым). Этот комплекс не разрушается при действии спирта, и бактерии сохраняют фиолетовый цвет.
Грамотрицательные бактерии не способны удержать основной краситель, так как не содержат магниевой соли РНК. Под действием спирта краситель вымывается, клетки обесцвечиваются и окрашиваются дополнительным красителем (фуксином) в красный цвет.
1. На препарат накладывают бумажку по Синеву и наносят несколько капель воды или раствор генцианового фиолетового. Окрашивают 1-2 мин. Снимают бумагу или сливают краситель.
2. Не промывая водой, наносят раствор Люголя до почернения (1 мин), затем краситель сливают.
3. Не промывая водой, наносят 96% спирт до отхождения красителя (30-60 с). Можно опустить препарат в стаканчик со спиртом на 1-2 с.
4. Промывают препарат водой.
5. Докрашивают фуксином Пфейффера 3 мин, промывают водой и высушивают.
Микроскопируют с помощью иммерсионной системы.
Окраска по Цилю — Нильсену (для кислотоустойчивых бактерий). Этот метод применяют для выявления бактерий туберкулеза и проказы, имеющих в оболочке клеток большое количество липидов, воска и оксикислот. Бактерии кислото-, щелоче- и спиртоустойчивы. Для увеличения проницаемости клеточной стенки первый этап окрашивания проводят при подогревании.
1. Фиксированный препарат покрывают фильтровальной бумагой и наносят фуксин Циля. Удерживая стекло пинцетом, препарат подогревают над пламенем горелки до отхождения паров. Добавляют новую порцию красителя и подогревают еще 2 раза. После охлаждения снимают бумагу и промывают препарат водой.
2. Препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты, погружая 2-3 раза в раствор или наливая кислоту на стекло, затем несколько раз промывают водой.
3. Окрашивают водно-спиртовым раствором метиленового синего в течение 3-5 мин, промывают водой и высушивают.
Микроскопируют с помощью иммерсионной системы.
Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, остальные — в синий (см. рис. 4).
Окраска по Ожешко (выявление спор). 1. На высушенный на воздухе мазок наливают несколько капель 0,5% раствора хлороводородной кислоты и подогревают до образования паров. Препарат высушивают и фиксируют над пламенем.
2. Окрашивают по способу Циля — Нильсена. Кислотоустойчивые споры окрашиваются в розово-красный, а бактериальная клетка — в голубой цвет (см. рис. 4).
Окраска по Бурри — Гинсу (выявление капсулы). Этот метод назван негативным, так как окрашивается фон препарата и бактериальная клетка, а капсула остается неокрашенной.
1. На предметное стекло наносят каплю черной туши, разведенной в 10 раз. В нее вносят каплю культуры. Ребром шлифовального стекла делают мазок, так же как мазок крови, и высушивают.
2. Фиксируют химическим способом спиртом или сулемой. Осторожно промывают водой.
3. Окрашивают фуксином Пфейффера 3-5 мин. Осторожно промывают и высушивают на воздухе.
Внимание! Фильтровальной бумагой не пользоваться, чтобы не повредить препарат.
Микроскопируют с помощью иммерсионной системы. Фон препарата черный, клетки — красные, капсулы — неокрашенные (см. рис. 4).
Дата добавления: 2016-11-22 ; просмотров: 1154 | Нарушение авторских прав
источник
Как указывалось выше, мазок может быть приготовлен непосредственно из нативного (необработанного) материала или его осадка (при исследовании жидких материалов).
Если мазок будет окрашиваться по методу Ziehl-Neelsen и исследоваться в световом микроскопе, рН мазка не корригируется.
В случае окраски флуорохромными красителями для исследования в люминесцентном микроскопе перед нанесением материала на предметное стекло необходимо добиться нейтрального значения рН (6,8-7,0). Уровень рН осадка определяют с помощью бумажной индикаторной полоски.
Перед приготовлением мазка на один конец стекла (или его матовую часть) наносят полный номер пробы исследуемого материала, под которым он зарегистрирован в лабораторном регистрационном журнале при приеме материала. Номер наносят с помощью алмазного карандаша или несмываемого маркера с таким расчетом, чтобы в процессе окраски этот номер сохранился.
Не следует касаться чистой поверхности стекла руками или перчатками.
Приготовление мазков для прямой микроскопии из нативной мокроты.
Если материал поступил в емкости, в которой невозможно обнаружить и выбрать частицы для приготовления мазка, его переносят в чашку Петри, под дно которой подложена черная бумага. При этом проявляют известную осторожность, чтобы избежать образования аэрозолей.
Так как в необработанной нативной мокроте микобактерии наиболее часто располагаются в плотных комочках распада тканей, следует иметь в виду, что результат микроскопического исследования в значительной степени зависит от правильности выбора этих гнойных комочков.
При приготовлении мазков наиболее удобно пользоваться деревянной палочкой, которую перед работой разламывают пополам.
Затем из разных участков образца мокроты выбирают 2-3 наиболее плотных гнойных небольших комочка, переносят их на стекло, при необходимости разминают его и равномерно распределяют тонким слоем в центре стекла на поверхности приблизительно размером 1×2 см в виде овала. Забор комочков производят с помощью сломанных концов палочки, что обеспечивает более надежную фиксацию материала к палочке и облегчает последующее его нанесение на поверхность предметного стекла и приготовление мазка посредством растирания.
На одно предметное стекло следует наносить только один мазок.
Использованные для приготовления мазка палочки удаляют в банку с дезинфицирующим раствором или в контейнер с отработанным заразным материалом. Для каждой порции мокроты используется новая чистая палочка.
Практикуется также приготовление мазков с помощью бактериологических петель или препаровальных игл. Удобно пользоваться двумя петлями или иглами. В случае, когда мазок готовят с помощью бактериологической петли, она может быть использована повторно после очистки от остатков мокроты путем 2-Зх кратного погружения ее в банку с песком, залитым спиртом, и последующего прожигания в пламени горелки до появления красного цвета. После прокаливания петлю следует охладить, оставив ее на 1-2 минуты в штативе-петледержателе.
Песок для очистки петель может использоваться длительное время при условии периодического обновления раствора спирта с таким расчетом, чтобы его уровень превышал уровень песка не менее чем на Зсм.
Приготовления мазка из осадка необработанного нативного материала.Такие мазки приготавливают из полученного после центрифугирования осадка любого жидкого диагностического материала (бронхоальвеолярные смывы, промывные воды бронхов или желудка, моча, пунктаты из закрытых полостей, экссудаты и др.). Осадок представляет собой обогащенную фракцию диагностического материала и значительно чаще позволяет получить положительные результаты. Особенностью существования М. tuberculosis в жидкостях является способность их долгое время находиться во взвешенном состоянии. В связи с этим рекомендуется производить центрифугирование при 3000 g (см. Приложение № 11 настоящего приказа).
Для приготовления мазка, надосадочную жидкость аккуратно удаляют, полученный в пробирке осадок перемешивают и с помощью пипетки наносят на стекло 1-2 капли осадка, распределяя его тонким слоем в центре стекла на площади не менее 1 см х 2 см.
Необходимо иметь в виду, что мазки из осадка жидких материалов (моча, промывные воды бронхов, экссудаты и пр.) легко смываются в процессе окраски. Поэтому мазки из осадка жидких материалов желательно приготавливать на стеклах, предварительно обработанных яичным белком.
Для этого белок куриного яйца в течение 30 — 40 минут взбивают с чистыми стерильными стеклянными бусами в стерильной посуде и оставляют на 1 — 1,5 часа при комнатной температуре. Затем жидкую часть взбитой смеси отбирают пипеткой, переносят ее в другую посуду и, смачивая в ней ватный тампон, аккуратно наносят ее на чистые обезжиренные предметные стекла, равномерно распределяя по 2/3 их поверхности. 1/3 предметного стекла оставляется необработанной белком для последующего нанесения на нее номера пробы. Обработанные белком стекла раскладывают на чистой фильтровальной бумаге и высушивают при комнатной температуре. Стекла готовят накануне их использования. Срок хранения не превышает 2-х суток.
Другим способом закрепления осадка жидкого материала является использование сыворотки крови. На чистом стекле каплю сыворотки смешивают с 1-2 каплями осадка материала и распределяют смесь по стеклу.
При приготовлении мазка для микроскопического исследования необходимо добиваться правильной его толщины. Если мазок слишком тонкий и содержит мало материала, при микроскопическом исследовании можно получить ложноотрицательный результат.
Если мазок слишком толстый, это затрудняет его фиксацию, материал недостаточно плотно прикрепляется к стеклу и может быть частично или полностью удален при окраске. Кроме того, толстый мазок плохо просматривается при микроскопическом исследовании.
Не рекомендуется готовить мазки способом «растяжки» материала между двух предметных стекол. Такой способ сопровождается образованием биологически опасного аэрозоля.
Через правильно приготовленный не окрашенный мазок можно читать газетный шрифт, расположенный позади стекла на расстоянии 5 -10 см.
Ограниченная площадь мазка (
1 см х 2 см в центре стекла) значительно повышает безопасность манипуляции и последующей микроскопии, так как периферические части и ребра предметного стекла остаются незагрязненными инфекционным материалом.
источник
Для изучения микроорганизмов в окрашенном виде на предметном стекле делают мазок, высушивают, фиксируют его и после этого окрашивают.
Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного предметного стекла.
Мазки готовят из культур микробов, патологического материала (мокрота, гной, моча, кровь и др.) и из органов трупов.
Техника приготовления мазков определяется характером исследуемого материала.
Приготовление мазков из микробных культур с жидкой питательной средой и из жидкого патологического материала (моча, ликвор и др.). Маленькую каплю исследуемой жидкости наносят бактериальной петлей на предметное стекло и круговыми движениями петли распределяют равномерным слоем в виде кружка диаметром в копеечную монету.
Приготовление мазков из крови. На предметное стекло, ближе к одному из его концов, наносят каплю крови. Второе — шлифованное — стекло, которое должно быть уже предметного, ставят на первое под углом 45° и подводят к капле крови до соприкосновения с ней. После того как кровь растечется по шлифованному краю, стеклом делают скользящее движение справа налево, равномерно распределяя кровь тонким слоем по всей поверхности стекла. Толщина мазка зависит от величины угла между стеклами: чем острее угол, тем тоньше мазок. Правильно приготовленный мазок имеет светло-розовую окраску и одинаковую толщину на всем протяжении.
Приготовление толстой капли. На середину предметного стекла пастеровской пипеткой наносят каплю крови или прикладывают стекло непосредственно к выступающей капле крови. Нанесенную на стекло кровь размазывают бактериальной петлей так, чтобы диаметр образующегося мазка соответствовал величине копеечной монеты. Стекло оставляют в горизонтальном положении до высыхания крови. Кровь в «толстой капле» распределяется неравномерно, образуя неровный край.
Приготовление мазка из вязкого материала (мокрота, гной). Мокроту или гной, нанесенные на предметное стекло ближе к узкому краю, накрывают другим предметным стеклом. Стекла слегка придавливают друг другу.
После этого свободные концы стекол захватывают 1 и 2 пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны так, чтобы при движении оба стекла плотно прилегали друг к другу. Получаются мазки с равномерно распределенным материалом, занимающим большую площадь.
Приготовление мазка из культур с плотных питательных сред. На середину чистого, хорошо обезжиренного предметного стекла наносят каплю воды, в нее вносят бактериальную петлю с небольшим количеством исследуемой микробной культуры, так, чтобы капля жидкости стала слегка мутноватой. После этого излишек микробного материала на петле сжигают в пламени и приступают к приготовлению мазка по вышеописанному способу.
Приготовление мазков из органов и тканей. Поверхность органа с целью обеззараживания прижигают накаленными браншами пинцета, делают по этому месту надрез и из глубины остроконечными ножницами вырезают небольшой кусочек ткани, который помещают между двумя предметными стеклами. Далее поступают так же, как при приготовлении мазка из гноя и мокроты. Если ткань органа плотная, то из глубины разреза делают скальпелем соскоб. Полученный при соскабливании материал распределяют тонким слоем по поверхности стекла скальпелем или бактериальной петлей.
Для изучения взаимного расположения элементов ткани и находящихся в ней микроорганизмов делают мазки-отпечатки. Для этого вырезанный из середины органа небольшой кусочек ткани захватывают пинцетом и прикладывают последовательно несколько раз поверхностью среза к предметному стеклу, получая, таким образом, ряд мазков-отпечатков.
Высушивание и фиксация мазков. Приготовленный на предметном стекле мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.
Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение средств, вызывающих коагуляцию белков. Нельзя фиксировать над пламенем мазки, содержащие возбудителей I – II групп патогенности.
Физический способ фиксации. Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за ребра мазком кверху и плавным движением проводят 2—3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с. Надежность фиксации проверяют следующим простым приемом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога.
Химический способ фиксации. Для фиксации мазков применяют также химические вещества и соединения, приведенные в таблице 4.
Вещества для химической фиксации
| Фиксирующее вещество | Время фиксации, мин |
| Безводный метиловый спирт | |
| Этиловый спирт 96% | 10—15 |
| Жидкость Никифорова (смесь этилового спирта и эфира в соотношении 1:1) | 10—15 |
| Жидкость Карнуа (этанола 96% 60 мл, хлороформа 30 мл, уксусной кислоты ледяной 10 мл) | 10-15 |
| H2O2 3% в 96% спирте (для фиксации споровых микроорганизмов) |
Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом и затем высушивают на воздухе.
источник
Методические указания к практическому занятию
По дисциплине ОП.06 Основы микробиологии и иммунологии
для студентовспециальности 34.02.01 Сестринское дело
Тема: Приготовление микробиологических препаратов
Цель занятия:научиться готовить микробиологические мазки из агаровой культуры, бульонной культуры, крови, гноя, мокроты и трупного материала.
После выполнения практической работы студенты должны уметь:
— готовить микробиологические препараты из нативного материала;
— готовить микробиологические препараты из бульонной и агаровой культуры;
— владеть навыками фиксации мазка.
Студенты должны знать:
— правила работы в микробиологической лаборатории;
— меры безопасности при работе с инфицированным материалом;
— методы микробиологического исследования;
-терминологию, используемую для характеристики микробиологических препаратов.
Практическая работа способствует формированию следующих компетенций:
ОК 1. Понимать сущность и социальную значимость своей будущей профессии, проявлять к ней устойчивый интерес;
ОК 3. Принимать решения в стандартных и нестандартных ситуациях и нести за них ответственность.
ОК 4. Осуществлять поиск и использование информации, необходимой для эффективного выполнения профессиональных задач, профессионального и личностного развития.
ОК 6. Работать в коллективе и команде, эффективно общаться с коллегами, руководством.
ПК 2.5. Соблюдать правила использования аппаратуры, оборудования и изделий медицинского назначения в ходе лечебно-диагностического процесса.
План занятия
II. Инструктаж к практической работе. Демонстрация манипуляций по теме.
III. Самостоятельная работа студентов. Оформление дневников по практике
IV. Отчет о проделанной работе. Выходной контроль
Ход занятия.
I. Ответьте на вопросы входного контроля:
1. Правила работы в микробиологической лаборатории.
2. Какие существуют особенности работы с инфицированным материалом?
3.Какая лабораторная посуда и оборудование используются для приготовления микробиологических препаратов?
4.Какие существуют основные формы бактерий?
5.Цели и способы фиксации мазка.
6.Техника приготовления мазков.
II.Инструктаж к практической работе
Используя методические указания, изучите правила приготовления микробиологических мазков из агаровой культуры, бульонной культуры, крови, гноя, мокроты и трупного материала.
III. Самостоятельная работа студентов:
Приготовьте мазок с плотной питательной среды.
А) Обезжирить предметное стекло. Для чего предметные стекла помещают на 2-3 дня в смесь Никифорова (равные объемы спирта и эфира) или в 96% спирт.
Б) На положенное на стол стекло, прокаленной на спиртовке петлей наносят каплю изотонического раствора хлорида натрия (0,9%).
В) Берут левой рукой пробирку с культурой.
Г) Правой рукой берут бактериологическую петлю и прожигают ее в пламени спиртовки.
Д) Вынимают мизинцем правой руки пробку из пробирки. Прожигают горло пробирки над пламенем спиртовки.
Е) вводят петлю в пробирку. Охлаждая ее о стенки пробирки, если она горячая.
Ж) Захватывая петлей небольшую часть культуры, выводят ее из пробирки, не касаясь стенок.
З) Закрывают пробирку пробкой над пламенем спиртовки и ставят ее в штатив.
И) Петлю с культурой опускают на стекло и растирают культуру рядом с каплей изотонического раствора, а затем постепенно эмульгируют в этом растворе.
К) Остатки культуры на петле сжигают в пламени спиртовки.
Л) Мазок высушивают, фиксируют, окрашивают.
2. Приготовьте мазок с жидкой питательной среды.
Приготовление мазка из жидкой культуры отличается от выше описанного способа приготовления только тем, что здесь можно использовать не только петлю, но и Пастеровскую пипетку, которую обязательно после использования опускают в дезинфицирующий раствор.
3. Приготовьте мазок из гноя или мокрот.
Материал забирают стерильной петлей или пипеткой и наносят на середину предметного стекла. Затем вторым предметным стеклом покрывают первое так, чтобы остались свободными треть первого и второго стекол. Стекла раздвигают в стороны и получают два отдельных мазка.
Рисунок 1 – Приготовление мазка из гноя и мокроты
4. Приготовьте мазок из крови.
Каплю крови наносят ближе к краю стекла. Затем краем второго отшлифованного стекла прикасаются к капле крови, располагая стекло под углом 45 0 . Прижимая отшлифованное стекло к предметному, продвигая его. Хорошо сделанный мазок имеет желтоватый цвет.
Рисунок 2 –Приготовление мазка из крови (стрелка показывает направление движения шлифовального стекла)
5. Приготовьте мазок из трупного материала.
Раскаленным скальпелем прижигают поверхность орган и из этого участка вырезают кусочек материала, затем поверхностью этого кусочка прикасаются к предметному стеклу в двух – трех местах, делая ряд мазков-отпечатков.
Высушивание – мазки высушивают на воздухе при комнатной температуре или в термостате.
Фиксация. Мазки фиксируют после полного высыхания с целью закрепить мазок на стекле и обезвредить (убить) микроорганизмы. Для этого применяют спиртовку. Держа стекло вверх мазком, его трижды проводят через пламя спиртовки (6 сек).
Мазки из крови и трупного материала лучше фиксировать жидкостью, т.к. клеточные элементы в мазках при действии высокой температуры разрушаются.
а) метиловый спирт – 5 минут
в) смесь Никифорова – 10-15 мин
Окраска препарата может быть простой и сложной.
Бактериальная петля состоит из трех частей: ручки (петледержателя), головки и самой петли (проволочки).
источник
Мазки-препараты готовят из гноя, мокроты, фекалий больных, колоний или налета чистых культур протистов, выросших на питательных средах в чашках Петри или пробирках. Мазки делают на предметных стеклах, как правило, бактериальной петлей (диаметр 3×2 мм) из нихромовой проволоки, конец которой укрепляют зажимом в специальном петледержателе или впаивают в стеклянную палочку Кроме того, для изготовления мазков необходимы газовая горелка или спиртовка, ванночка с подставкой (мостик) для стекол, промывалка с водой, флакон с изотоническим раствором хлористого натрия, красители, фильтровальная бумага, банки с дезинфицирующим раствором для обезвреживания отработанных препаратов, пипеток, материалов и рабочего стола.
Этапы приготовления мазка. 1. Исследуемые материалы и культуры простейших берут бактериальной петлей, которую стерилизуют в пламени горелки. При ее введении в пробирки и колбы стерилизуют не только петлю, но также верхнюю часть петледержателя. При этом пробирку с культурой берут большим и указательным пальцами левой руки, а бактериальную петлю держат правой, как ручку. Ватную пробку зажимают мизинцем правой руки и извлекают из пробирки. Края горлышка пробирки стерилизуют в пламени горелки и почти одновременно обжигают петлю, которую быстро вводят внутрь пробирки, охлаждают и прикасаются к налету на скошенном питательном агаре или же погружают ее в жидкую питательную среду. Затем петлю извлекают, быстро обжигают край пробирки, закрывают пробкой, проведенной через пламя, и ставят в штатив.
2. Налет чистой культуры простейших или колонию эмульгируют в капле воды на предметном стекле и круговыми движениями петли равномерно распределяют на площади диаметром 1,0–1,5 см. Точно такого же размера готовят мазок из бульонной культуры, гноя, мокроты, других материалов, которые, естественно, не взвешиваются в воде. Хорошо приготовленные тонкие мазки имеют округлую форму, быстро высыхают при комнатной температуре, более толстые – высушивают в термостате или при подогревании над пламенем горелки, не допуская свертывания белка простейших и гельминтов, нарушающего их структуру.
3. Высушенные мазки фиксируют 5–6 с в пламени спиртовки, чтобы убить протистов для лучшего восприятия ими красителей, закрепить их на предметном стекле и предотвратить их смыв при ополаскивании мазка водой после окраски.
Для приготовления мазков из гноя и мокроты пользуются двумя предметными стеклами (рис. 1). На середину одного из них наносят небольшое количество материала, который покрывают вторым стеклом так, чтобы осталась свободной треть первого и второго стекол. Раздвигая стекла в стороны, получают два больших мазка одинаковой толщины.
Мазки из крови готовят следующим образом. Стерильной иглой для инъекций делают укол предварительно продезинфицированного безымянного пальца левой руки. Первую каплю крови удаляют ватой, а вторую наносят на край хорошо обезжиренного предметного стекла. Мазки делают узким шлифованным стеклом (рис. 2), установленным под углом 45°, продвигая его вдоль предметного стекла в сторону, не доходя до края (мазок имеет желтоватый цвет и просвечивается).
Препараты-отпечатки из внутренних органов трупов, мяса, колбасных изделий получают, прикасаясь предметным стеклом к поверхности разрезов, выполненных стерильным скальпелем.
Рис. 1. Приготовление мазка из гноя и мокроты
Рис. 2. Техника приготовления мазка из крови (стрелка показывает направление движения шлифованного
Приготовленные таким образом препараты из гноя, мокроты, крови, органов и тканей, деформирующихся при высокой температуре, обрабатывают метиловым спиртом -5 мин, этиловым спиртом -10-15 мин, смесью Никифорова (равные объемы этилового спирта и эфира) – 10–15 мин, ацетоном – 5 мин, парами осмиевой кислоты и формалина -10-20 с.
4. Фиксированные мазки окрашивают кислыми, щелочными и нейтральными анилиновыми красителями.
Наиболее широко при простом (однократном) способе окраски мазков применяются водный фуксин Пфейффера, метиленовый синий Леффлера и генцианвиолет.
Водный фуксин готовится из концентрированного фенолового фуксина Циля (основной фуксин – 1 г; спирт 96 %-ный -10 мл; фенол кристаллический – 5 г; глицерин – несколько капель; вода дестиллированная – 100 мл), разводя его дестиллированной водой в соотношении 1:10. При этом насыщенный кристаллами фенола фуксин Циля растирают в ступке до гомогенной массы, добавляя малыми порциями спирт. Затем, не прекращая помешивания, постепенно доливают 9 частей дистиллированной воды. Через 48 ч выдерживания при комнатной температуре раствор фильтруют, после чего фуксин Пфейффера готов к употреблению.
Метиленовый синий Леффлера готовят путем прибавления к 30 мл насыщенного раствора метиленового синего (10 г метиленового синего в 100 мл 96 %-ного этилового спирта) 1 мл 1 %-ного натрия гидроксида или калия гидроксида и 100 мл дестиллированной воды; везу вин – растворяя 2 г порошка в смеси 60 мл 96 %-ного спирта и 40 мл дистиллированной воды при нагревании до кипения, с последующей фильтрацией.
Для приготовления генцианвиолета берут 1 г красителя и растворяют его в феноловом растворе – 100 мл дестиллированной воды, 2 г кристаллического фенола и 10 мл 96 %-ного этанола.
После окрашивания красители сливают, препарат промывают водой и высушивают между листами фильтровальной бумаги. На сухой мазок наносят каплю масла и микроскопируют с использованием иммерсионного объектива оптического микроскопа.
При сложных методах окраски мазков применяют два-три различных по цвету красителя, что позволяет дифференцировать протистов и выявлять некоторые нюансы в деталях их строения. К таким методам относят окраску по Цилю – Нельсену, Романовскому – Гимзе и некоторые другие.
Мазок для люминесцентной микроскопии готовят обычным образом, фиксируют в ацетоне 5-10 мин и наносят на него флюорохром на 20–30 мин. В качестве флюорохромов используют аурамин, акридин желтый, флюоресцеинизотиоцианат. Готовый препарат 15–20 мин промывают проточной водой, покрывают покровным стеклом и микро скопируют.
Для электронной микроскопии вместо предметных стекол применяются очень тонкие пленки-подложки, незначительно поглощающие электроны. Они крепятся на опорные сетки. Материалом для приготовления пленок служит коллодий, оксид алюминия и кварц. Исследуемый материал, тщательно очищенный от различных примесей, наносят на пленку, на которой после испарения жидкости остается тончайший слой. Высушенный препарат устанавливают для микроскопирования. Контрастирование препаратов осуществляется с помощью электроноплотных (задерживающих электроны) веществ: напыление тяжелыми металлами, обработка препаратов фосфорно-вольфрамовой кислотой и уранилацетатом.
Чистые культуры патогенных протистов выделяют на элективных средах, куриных эмбрионах, культурах человеческих клеток, a Trypanosoma kruzi культивируют в организме «поцелуйных клопов» путем вскармливания их на больных, но эту работу осуществляет хорошо обученный контингент сотрудников специализированных лабораторий и научно-исследовательских институтов.
Протесты нуждаются в самых разнообразных питательных веществах, одни из них используются для построения структурных элементов клетки, другие служат источником энергии. Питательные вещества поступают в протесты через оболочку. В процессе питания она играет роль сита. Главное значение в питании имеет цитоплазматическая мембрана. Через нее вещества проникают разными путями: 1) путем простой диффузии низкомолекулярных соединений, образующих истинные растворы; 2) путем облегченной диффузии, которая осуществляется с помощью белков-переносчиков, или байдинг-белков; 3) путем активного транспорта веществ при участии пермеаз.
Для нормальной жизнедеятельности протистов, как и для бактерий, необходимы: углерод, азот, водород и кислород, который они чаще всего получают из минеральных соединений. В их метаболизме используется сера, фосфор, калий, кальций, магний, железо и другие зольные элементы.
Для активации роста протистов им необходимы в микродозах бор, молибден, цинк, кобальт, никель, марганец, медь, йод, бром. Некоторым видам требуются аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания и витамины как ростовые вещества.
Источниками биогенов, других элементов, ростовых веществ для выращивания протистов являются мясо, рыба, овощи, органические добавки. В зависимости от свойств и назначения различают жидкие, полужидкие и плотные среды; натуральные, синтетические и полусинтетические; простые (основные), сложные и специальные.
Жидкие питательные среды готовят на водопроводной и дистиллированной воде. Для их уплотнения используют агар-агар (от 0,15 до 3 %), диоксид кремния, или силикагель (1,5 %) и желатин (10–15 %). При этом агар-агар получают специальной обработкой морских водорослей. Он является веществом полисахаридной природы, содержит незначительное количество азота. Студень, образуемый агаром, плавится при температуре 70-100 °C и застывает при комнатной температуре. Силикагель является продуктом прокаливания геля поликремниевой кислоты. Желатин представляет собой вещество белковой природы. Его готовят из костей, хрящей и отходов шкур телят.
Натуральные среды состоят из белковых продуктов животного, растительного и микробного происхождения. Химический состав их непостоянен и может в значительной степени варьировать.
К простым натуральным питательным средам относят мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), молоко и овощи, например кусочки картофеля, свеклы, моркови.
Основой для приготовления МПБ и МПА служит мясная вода. Готовят ее следующим образом. Свежую говядину или телятину, отделенную от костей, жира и сухожилий (500 г), пропускают через мясорубку, фарш заливают 1 л водопроводной воды, хорошо размешивают и оставляют на сутки в прохладном месте или помещают на 2 ч в термостат при температуре 37 °C. Далее настой мясного фарша отжимают через марлю, кипятят в течение 5 мин для свертывания белков, пропускают через ватный фильтр, доливают до первоначального объема водой и после разлива в колбы и флаконы стерилизуют в автоклаве. Содержащая определенное количество аминокислот, витаминов группы В, солей, углеводов, факторов роста, прочих экстрактивных веществ мясная вода после автоклавирования должна иметь вид прозрачной желтоватой жидкости слабокислой реакции (pH 6,2–6,4).
Для приготовления МПБ к мясной воде прибавляют 1 % сухого пептона (смесь альбумоз, полипептидов и аминокислот), 0,5 % натрия хлорида и, устанавливая нужный уровень pH среды (для бактерий-нейтрофилов – 7,2–7,6, для алкалифилов -7,8–8,6, для ацидофилов – 4,0–6,0), кипятят 30 мин, фильтруют и стерилизуют в автоклаве.
МПА готовят на бульоне, прибавляя хорошо промытый агар-агар, который после расплавления и охлаждения придает среде плотную (1,5–3 %) или полужидкую (0,15-0,4 %) консистенцию студня (геля).
В настоящее время бактериологические лаборатории широко используют сухие питательные среды в виде порошков, хранящихся в герметично закрытых банках. Готовят эти среды по указанным на этикетках прописям. Навеску порошка растворяют в определенном объеме дистиллированной воды, среду разливают в соответствующую посуду и стерилизуют. Преимуществом сухих производственных сред является постоянство их состава, стандартность, удобство в приготовлении, легкость транспортировки.
Молоко как простая среда становится пригодным для выращивания бактерий лишь после снятия сливок, для чего требуется отстаивать его в холодильнике, а овощи – после очищения от кожуры и получения сочных ломтиков.
Сложные питательные среды готовят на основе МПБ или МПА, добавляя к ним углеводы, сыворотку, молоко, дефибринированную кровь животных и человека, асцитическую жидкость брюшной полости больных. Среди них выделяют специальные среды, которые по своему назначению делят на селективные (элективные) и дифференциально-диагностические.
Синтетические среды создаются из химически чистых соединений в строго определенных концентрациях в зависимости от потребностей микроорганизмов в факторах роста. Готовят их на основе минимальных сред.
Важным показателем пригодности среды является ее pH, которая для большинства патогенных микробов соответствует 7,2–7,4.
По температурному оптимуму роста бактерии подразделяют на психро- (15–20 °C), термо- (50–60 °C) и мезофилы (30–37 °C). Болезнетворные виды микробов в большинстве своем – мезофилы.
Вырастая на поверхности плотных питательных сред, отдельные особи микробов, а также протесты образуют колонии, представляющие собой однородную популяцию клеток. При этом у разных видов бактерий, грибов и микоплазм колонии неодинаковы по размерам, очертаниям, характеру поверхности, особенностям краев, прозрачности, влажности, консистенции, окраске и пр. При густом засеве плотная среда покрывается сплошным налетом культуры, который называют газоном.
Питательные среды готовят в эмалированной и стеклянной посуде. Новую стеклянную посуду для нейтрализации растворимой щелочи кипятят в 1–2 %-ном растворе соляной кислоты, а бывшую в употреблении – моют в мыльном или содовом растворе. Ту и другую прополаскивают, тщательно промывают в проточной воде и сушат. Сухие флаконы, колбы, пробирки заливают питательными средами, закрывают ватными тампонами (пробками) и стерилизуют.
Существует несколько способов посева, но каждый из них может отличаться некоторыми техническими особенностями, зависящими от инструмента засева, консистенции питательной среды, посуды, в которой она находится, характера засеваемого вида протесты, материала, в котором он содержится. При этом засев производят бактериальной петлей или иглой, микробиологическим шпателем, градуированной пипеткой. К основным из них относятся посевы бактериальной петлей и шпателем.
Посев бактериальной петлей на скошенную и жидкую среды в пробирках. Приступая к засеву, в левой руке размещают две пробирки, например с чистой культурой бактерий и со стерильной средой, держа их в наклонном положении так, чтобы не проливалось имеющееся в них содержимое. В правую руку, как пишущую ручку, берут петлю и в вертикальном положении фламбируют в пламени горелки. Пробки из пробирок вынимают одновременно, зажав их между мизинцем и ладонью правой руки, тотчас же обжигают края горлышек пробирок. Прокаленную петлю вводят в пробирку, охлаждают, прикасаются к культуре и быстро переносят ее в пробирку со средой, ополаскивая петлю в бульоне или распределяя штрихами по скошенной поверхности агара. Петлю извлекают, фламбируют края пробирок и закрывают их проведенными через пламя пробками, затем петлю стерилизуют, пробирки надписывают и ставят в штатив.
Посев уколом в столбики полутвердых сред. Обычно засевают полутвердые столбики МПА и желатина, насквозь прокалывая их иглой или петлей, при этом пробирки держат дном вверх. Посев применяют для выращивания бактерий-анаэробов, хранения культур, выявления ферментативных свойств.
Посев пипетками. Пробирку (колбу), содержащую жидкую среду, держат левой рукой под небольшим углом, а градуированную пипетку с материалом под таким же наклоном, но в обратном положении – в правой. Переносят его в питательную среду после снятия пробки и фламбирования горлышка пробирки, погружая кончик пипетки до дна. Материал выдувают и тщательно перемешивают в среде. Пробирки закрывают, а пипетки помещают в дезинфицирующий раствор.
Приготовленные впрок плотные питательные среды, например МПА, расплавляют и, остудив их до 50–60 °C, берут флакон в правую руку, а левой вынимают пробку, обжигая горлышко. Большим и указательным пальцами левой руки приподнимают крышку чашки Петри и, не касаясь ее краев, вводят под нее горлышко, выливая 15–20 мл среды. Быстро закрывают крышку и флакон. Чашку слегка покачивают для равномерного распределения среды и оставляют на столе для застывания. Затем переносят ее в термостат, переворачивают вверх дном, снимают крышку и в таком положении 15–20 мин подсушивают в термостате.
Посев бактериальной петлей. Исследуемый жидкий материал набирают петлей и, не прикасаясь к стенке пробирки, встряхивают для удаления излишка. Чашку Петри с агаризованной средой помещают на столе вверх дном. Донную часть чашки берут левой рукой и держат почти вертикально, петледержатель – большим и указательным пальцами правой руки; легкими движениями наносят оставшуюся часть материала параллельными штрихами по всему диаметру поверхности среды.
Посев шпателем. Шпатели готовят из стеклянных палочек толщиной 4–5 мм, согнутых в виде треугольника. Стерилизуют их завернутыми в бумагу в сухожаровом шкафу, а также сжиганием спирта после предварительного их смачивания. Засевают шпателем каплю материала или взвеси микробов, распределяя ее круговыми движениями по всей поверхности питательной среды и удерживая левой рукой крышку чашки Петри в приоткрытом положении. Одним шпателем тем же приемом засеваются поочередно вторая и третья чашки, после чего его погружают в банку с дезинфицирующим раствором. Чашки переворачивают, надписывают и ставят в термостат вверх дном, чтобы избежать размывания растущих колоний на среде капельками конденсационной воды, которые скапливаются на внутренней поверхности крышки при обычном ее положении.
Патологическими материалами, которые используются для посева на питательные среды, могут быть кровь, спинномозговая жидкость, пунктаты (от лат. punctum – прокалывать), например полостей и лимфоузлов (секреты), рвотные массы, промывные воды желудка, моча, испражнения, гной, слизь, мокрота (экскреты). Эти и другие материалы берутся стерильными инструментами и помещаются в стерильные банки, флаконы, пробирки и направляются на исследование.
В сопроводительном листе, прилагаемом к пробам, должны быть указаны фамилия, инициалы больного или умершего, материал, цель исследования, название направляющего пробы учреждения, адрес лаборатории, куда они доставляются, и дата.
При микробиологическом исследовании материалов нужно строго соблюдать правила противоэпидемического режима, исключающие возможность внутрилабораторного инфицирования, и, прежде всего, неукоснительно выполнять рекомендации по предотвращению заражения вирусами гепатитов и СПИДом.
Чистая культура – это биомасса одинаковых особей микроорганизмов (колонии), полученных на питательной среде из патологического материала, глубокое исследование которой позволяет установить видовую принадлежность возбудителя и природу инфекционного заболевания.
Приступая к выделению чистой культуры, следует иметь в виду, что возбудители в экскретах находятся в ассоциации с банальной (посторонней) микрофлорой. Для их изоляции гной,
мокроту, осадок мочи, испражнения необходимо засеять так, чтобы получить изолированные колонии. С этой целью они засеваются частыми штрихами бактериальной петлей по всей поверхности агаризованных сред в чашках Петри. Взятые тампонами слизь из зева, смывы с рук и предметов засевают на пластинчатые среды круговыми движениями или тампоны вначале отжимают в жидких средах с последующим штриховым отсевом бактериальной петлей.
Выросшие колонии после детального изучения пересевают на скошенные и жидкие среды. Накопив в них биомассу чистой культуры, на I этапе идентификации вида исследуют ее морфолого-культуральные свойства.
Окончательное определение видовой принадлежности выделенной культуры осуществляют на II этапе идентификации после всестороннего исследования: 1) спектра ферментов; 2) антигенной и генотипической структуры микроорганизмов с помощью диагностических иммунных сывороток, ДНК-зондирования и полимеразной цепной реакции.
Патогенные протесты имеют сложную антигенную структуру и содержат гораздо больший набор антигенов, чем бактерии. Организм больного человека реагирует на антигены протестов развитием разнообразных гуморальных и клеточных защитных реакций, но эффективность их при разных инвазиях неодинакова, что зависит от вида и локализации паразита в организме.
Так, при паразитемиях (развитие простейших в крови) вырабатывается большое количество паразитоцидных иммуноглобулинов, однако полной элиминации циркулирующих в крови простейших они не вызывают. Под их влиянием у части простейших быстро развивается изменчивость антигенной структуры. К таким паразитам, например, можно отнести африканские трипаносомы и малярийные плазмодии. Дизентерийные амебы, жиардии, трихомонады – слабые иммуногены. В ответ на их воздействие организм продуцирует невысокий титр антител. Столь же ограничена индукция клеточных иммунных реакций.
Паразитирующие в спинномозговой жидкости и головном мозге простейшие и гельминты иммунологических реакций не вызывают. Более того, такая локализация защищает их от паразитоцидного действия иммуноглобулинов, фагоцитов и цитотоксических лимфоцитов.
При протозойных инвазиях и гельминтозах могут быть использованы все иммунологические реакции, но чаще всего, – реакция иммунофлюоресценции, реакция связывания комплемента, реакция непрямой гемагглютинации и иммуноферментный анализ, которые, однако, часто оказываются недостаточно специфичными вследствие медленного нарастания антипротозойных и антигельминтных иммуноглобулинов или низкого их титра. В отличие от этого при паразитарных болезнях в крови закономерно нарастает титр аллергических иммуноглобулинов.
источник
Бактериоскопическое исследование мокроты
КРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ ОБРАЗОВАНИЯ МОКРОТЫ
Кристаллы Шарко-Лейдена – блестящие бесцветные ромбы различной величины, напоминающие стрелки компаса. Образуются из распадающихся эозинофилов. Часто свежевыделенная мокрота не содержит кристаллов Шарко-Лейдена, они образуются в ней через 24 часа. Присутствие этих кристаллов в мокроте характерно для бронхиальной астмы, встречается также при глистных поражениях легких.
Кристаллы гематоидинаимеют вид ромбов или иголок золотисто-желтого цвета. Являются продуктом распада гемоглобина. Образуются в глубине гематом, в некротизированной ткани. В препаратах мокроты располагаются на фоне детрита, эластических волокон.
Кристаллы холестерина — бесцветные четырехугольные пластинки с обломанным углом, образуются при распаде жироперерожденных клеток, задержке мокроты в полостях. Встречаются при кавернозном туберкулезе, опухолях и абсцессах легких.
Для исследования морфологии клеточных элементов мокроты используют обычные гематологические методы окраски – по Романовскому, Паппенгейму и др. В окрашенных препаратах дифференцируются нейтрофилы, эозинофилы, лимфоциты, базофилы, альвеолярные макрофаги, эпителиальные клетки, клетки злокачественных опухолей.
Этот этап исследования мокроты в клинико-диагностических лабораториях общей лечебной сети включает в себя микроскопию препаратов, окрашенных:
— по Цилю-Нильсену для выявления микобактерий туберкулеза (кислотоустойчивых микобактерий, КУМ);
— по Грамму для изучения микрофлоры мокроты (выявления стрептококков, стафилококков, пневмококков и др.). Бактериоскопическое исследование окрашенных по Грамму препаратов имеет ориентировочное значение. Правильность выявления этих бактерий должна подтверждаться бактериологическим исследованием (посевом).
Бактериоскопическое исследование мокроты необходимо проводить в соответствии с правилами, изложенными в приложении №10 к приказу Минздрава России от 21.03.2003г. №109. Сбор мокроты для анализа на кислотоустойчивые микобактерии (КУМ) изложен в общих правилах сбора мокроты.
Процедура приготовления мазков для бактериоскопического исследования начинается с подготовки предметных стекол. Необходимо использовать только новые стекла ГОСТ 9284-75 , отмытые и обезжиренные в спирте или смеси Никифорова (96% этиловый спирт + эфир в соотношении 1:1), без царапин и сколов. Новые предметные стекла кипятят 15 минут в 1% растворе питьевой соды, промывают в 1% растворе соляной кислоты, а затем в проточной воде и протирают насухо. Для обезжиривания вымытые и высушенные стекла помещают в герметически закрытые емкости со смесью Никифорова или с 96% этиловым спиртом не менее чем на 1 сутки. Непосредственно перед приготовлением мазков стекла повторно протираются насухо.
Техника приготовления мазков из мокроты изложена выше.
При приготовлении мазка необходимо добиваться правильной его толщины. Если мазок слишком тонкий и содержит мало материала, при микроскопическом исследовании можно получить ложноотрицательный результат. Если мазок слишком толстый, это затрудняет его фиксацию, материал недостаточно плотно прикрепляется к стеклу и может быть частично или полностью удален при окраске. Кроме того, толстый мазок плохо просматривается при микроскопическом исследовании. Через правильно приготовленный неокрашенный мазок можно читать газетный шрифт, расположенный позади стекла на расстоянии 5-10см.
Фиксация мазков.Приготовленные мазки помещают на 15-30 минут на лотки (подносы), выстланные фильтровальной бумагой, и высушивают при комнатной температуре в вытяжном шкафу или при его отсутствии — на столе, в специально отведенном месте. Ни в коем случае не допускается фиксация сырых мазков над пламенем горелки. Стекла с высохшими мазками пинцетом или специальными щипцами берут за конец, на который нанесена маркировка, и трижды медленно проводят через верхнюю треть пламени спиртовки или газовой горелки до исчезновения признаков запотевания стекла. Общая продолжительность пребывания мазка в пламени не должна превышать 3-5 секунд. Затем стекла помещают на специальную подставку («рельсы») для окрашивания.
В плане охраны труда оптимальным является метод Хайна, согласно которому предметные стекла с мазками раскладывают на жестяные или эмалированные подносы и помещают в сушильный шкаф, где сначала высушивают при 37°C, а затем температуру повышают до 105°C и через 10 минут шкаф выключают. При таком методе достигается надежное прикрепление материала к стеклу и гибель микобактерий, как находящихся в материале мазка, так и случайно попавших на поднос. Фиксирующая температура не должна превышать 105°С, чтобы не изменить свойства микобактерий.
Высушенные и фиксированные мазки должны сразу же окрашиваться. Нефиксированные мазки ни в коем случае не должны оставляться открытыми на ночь, так как это увеличивает опасность распространения инфекции и возможность переноса ее насекомыми. Фильтровальная бумага, которой был выстлан лоток (поднос), по окончании фиксации каждой серии мазков подлежит обязательному сжиганию или автоклавированию, а лоток обжигается спиртом. Лотки ежедневно выстилаются чистой бумагой.
Дата добавления: 2014-11-29 ; Просмотров: 2532 ; Нарушение авторских прав? ;
Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет
источник
Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности предметного хорошо обезжиренного стекла.
Мазки готовят из культур микробов, патологического материала (мокрота, гной, моча, кровь и др.) и из органов трупов.
Приготовление препарата для микроскопии складывается из следующих этапов:
1.Приготовление мазка на обезжиренном предметном стекле.
В правильно приготовленном препарате микробные клетки должны быть расположены в один слой.
Техника приготовления мазков определяется характером исследуемого материала.
Приготовление мазков из микробных культур с жидкой питательной среды и из жидкого патологического материала (моча и др.)
Маленькую каплю исследуемой жидкости наносят бактериальной петлей на предметное стекло и круговыми движениями петли распределяют равномерным слоем в виде кружка диаметром в копеечную монету.
Приготовление мазков из крови
На предметное стекло, ближе к одному из его концов, наносят каплю крови. Второе, шлифованное, стекло, которое должно быть уже предметного, ставят на первое под углом 45°, затем подводят к капле крови до соприкосновения с ней. После того как кровь растечется по шлифованному краю, стеклом делают скользящее движение справа налево, равномерно распределяя кровь тонким слоем по всей поверхности стекла. Толщина мазка зависит от величины угла между стеклами: чем острее угол, тем тоньше мазок. Правильно приготовленный мазок имеет светло-розовую окраску и одинаковую толщину на всем протяжении.
Приготовление толстой капли
На середину предметного стекла пастеровской пипеткой наносят каплю крови или прикладывают стекло непосредственно к капле крови, выступающей из пальца. Нанесенную на стекло кровь размазывают бактериальной петлей так, чтобы диаметр образующегося мазка соответствовал величине копеечной монеты. Стекло оставляют в горизонтальном положении до подсыхания крови. Кровь в “толстой капле” распределяется не равномерно, образуя неровный край.
Приготовление мазка из вязкого материала
Материал, нанесенный на предметное стекло ближе к узкому краю, накрывают другим предметным стеклом. Стекла слегка придавливают друг другу. После этого свободные концы стекол захватывают 1 и 2 пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны так, чтобы при движении оба стекла плотно прилегали друг к другу. Получаются мазки с равномерно распределённым материалом, занимающим большую часть.
Приготовление мазка из культур с плотных питательных сред
На середину чистого, хорошо обезжиренного стекла наносят каплю водопроводной воды, в нее вносят бактериальную петлю с небольшим количеством исследуемой микробной культуры так, чтобы капля жидкости стала слегка мутноватой. После этого излишек микробного материала на петле сжигают в пламени горелки и приступают к приготовлению мазка по описанному выше способу.
Приготовление мазков из органов и тканей
Поверхность органа с целью обеззараживания прижигают накаленными браншами пинцета, делают по этому месту надрез и из глубины остроконечными ножницами вырезают небольшой кусочек ткани, который помещают между двумя предметными стеклами. Далее поступают так же, как при приготовлении мазка из гноя и мокроты. Если ткань органа плотная, то из глубины разреза делают скальпелем соскоб. Полученный при соскабливании материал распределяют тонким слоем по поверхности стекла скальпелем пли бактериальной петлей. Для изучения взаимного расположения элементов ткани и находящихся в ней микроорганизмов делают мазки-отпечатки. Для этого вырезанный из середины органа небольшой кусочек ткани захватывают пинцетом и прикладывают поверхностью среза к предметному стеклу несколько раз последовательно, получая, таким образом, ряд мазков-отпечатков.
Рис. 4 Схема приготовления препарата-мазка
studopedia.org — Студопедия.Орг — 2014-2019 год. Студопедия не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования (0.001 с) . 
источник