Бактериоскопическое исследование мокроты
КРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ ОБРАЗОВАНИЯ МОКРОТЫ
Кристаллы Шарко-Лейдена – блестящие бесцветные ромбы различной величины, напоминающие стрелки компаса. Образуются из распадающихся эозинофилов. Часто свежевыделенная мокрота не содержит кристаллов Шарко-Лейдена, они образуются в ней через 24 часа. Присутствие этих кристаллов в мокроте характерно для бронхиальной астмы, встречается также при глистных поражениях легких.
Кристаллы гематоидинаимеют вид ромбов или иголок золотисто-желтого цвета. Являются продуктом распада гемоглобина. Образуются в глубине гематом, в некротизированной ткани. В препаратах мокроты располагаются на фоне детрита, эластических волокон.
Кристаллы холестерина — бесцветные четырехугольные пластинки с обломанным углом, образуются при распаде жироперерожденных клеток, задержке мокроты в полостях. Встречаются при кавернозном туберкулезе, опухолях и абсцессах легких.
Для исследования морфологии клеточных элементов мокроты используют обычные гематологические методы окраски – по Романовскому, Паппенгейму и др. В окрашенных препаратах дифференцируются нейтрофилы, эозинофилы, лимфоциты, базофилы, альвеолярные макрофаги, эпителиальные клетки, клетки злокачественных опухолей.
Этот этап исследования мокроты в клинико-диагностических лабораториях общей лечебной сети включает в себя микроскопию препаратов, окрашенных:
— по Цилю-Нильсену для выявления микобактерий туберкулеза (кислотоустойчивых микобактерий, КУМ);
— по Грамму для изучения микрофлоры мокроты (выявления стрептококков, стафилококков, пневмококков и др.). Бактериоскопическое исследование окрашенных по Грамму препаратов имеет ориентировочное значение. Правильность выявления этих бактерий должна подтверждаться бактериологическим исследованием (посевом).
Бактериоскопическое исследование мокроты необходимо проводить в соответствии с правилами, изложенными в приложении №10 к приказу Минздрава России от 21.03.2003г. №109. Сбор мокроты для анализа на кислотоустойчивые микобактерии (КУМ) изложен в общих правилах сбора мокроты.
Процедура приготовления мазков для бактериоскопического исследования начинается с подготовки предметных стекол. Необходимо использовать только новые стекла ГОСТ 9284-75 , отмытые и обезжиренные в спирте или смеси Никифорова (96% этиловый спирт + эфир в соотношении 1:1), без царапин и сколов. Новые предметные стекла кипятят 15 минут в 1% растворе питьевой соды, промывают в 1% растворе соляной кислоты, а затем в проточной воде и протирают насухо. Для обезжиривания вымытые и высушенные стекла помещают в герметически закрытые емкости со смесью Никифорова или с 96% этиловым спиртом не менее чем на 1 сутки. Непосредственно перед приготовлением мазков стекла повторно протираются насухо.
Техника приготовления мазков из мокроты изложена выше.
При приготовлении мазка необходимо добиваться правильной его толщины. Если мазок слишком тонкий и содержит мало материала, при микроскопическом исследовании можно получить ложноотрицательный результат. Если мазок слишком толстый, это затрудняет его фиксацию, материал недостаточно плотно прикрепляется к стеклу и может быть частично или полностью удален при окраске. Кроме того, толстый мазок плохо просматривается при микроскопическом исследовании. Через правильно приготовленный неокрашенный мазок можно читать газетный шрифт, расположенный позади стекла на расстоянии 5-10см.
Фиксация мазков.Приготовленные мазки помещают на 15-30 минут на лотки (подносы), выстланные фильтровальной бумагой, и высушивают при комнатной температуре в вытяжном шкафу или при его отсутствии — на столе, в специально отведенном месте. Ни в коем случае не допускается фиксация сырых мазков над пламенем горелки. Стекла с высохшими мазками пинцетом или специальными щипцами берут за конец, на который нанесена маркировка, и трижды медленно проводят через верхнюю треть пламени спиртовки или газовой горелки до исчезновения признаков запотевания стекла. Общая продолжительность пребывания мазка в пламени не должна превышать 3-5 секунд. Затем стекла помещают на специальную подставку («рельсы») для окрашивания.
В плане охраны труда оптимальным является метод Хайна, согласно которому предметные стекла с мазками раскладывают на жестяные или эмалированные подносы и помещают в сушильный шкаф, где сначала высушивают при 37°C, а затем температуру повышают до 105°C и через 10 минут шкаф выключают. При таком методе достигается надежное прикрепление материала к стеклу и гибель микобактерий, как находящихся в материале мазка, так и случайно попавших на поднос. Фиксирующая температура не должна превышать 105°С, чтобы не изменить свойства микобактерий.
Высушенные и фиксированные мазки должны сразу же окрашиваться. Нефиксированные мазки ни в коем случае не должны оставляться открытыми на ночь, так как это увеличивает опасность распространения инфекции и возможность переноса ее насекомыми. Фильтровальная бумага, которой был выстлан лоток (поднос), по окончании фиксации каждой серии мазков подлежит обязательному сжиганию или автоклавированию, а лоток обжигается спиртом. Лотки ежедневно выстилаются чистой бумагой.
Дата добавления: 2014-11-29 ; Просмотров: 2533 ; Нарушение авторских прав? ;
Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет
источник
Общие свойства мокроты и ее микроскопия. До того как мокрота будет исследована на наличие микобактерий, лаборант по ее внешнему виду определяет количество, запах, цвет, консистенцию, характер. Жидкую мокроту, состоящую из гнойных клеток, определяют как гнойную; мокроту с преобладанием гноя или слизи — как гнойно-слизистую или сли-зисто-гнойную; мокроту без гноя, содержащую только слизь, как слизистую, содержащую только кровь,— как кровянистую, а с примесью слизи и гноя — как кровянисто-слизисто-гнойную.
По консистенции мокрота может быть тягучей, студенистой, умеренно вязкой, жидкой.
В мокроте могут быть примеси, заметные невооруженным глазом: фибринозные слепки бронхов, кусочки ткани, бело-желтоватые комочки (дитриховские пробки), зерна «чечевицы» или «линзы» из омертвевшей ткани, детрита эластических волокон, беловатые полоски, свидетельствующие об обызвествленном распаде, пленчатые образования (эхинококк) и другие включения.
Далее под микроскопом исследуют нативный препарат мокроты, для чего готовят 2 препарата на одном предметном стекле и накрывают двумя покровными стеклами. Исследование проводят при малом увеличении (объектив 10, окуляр 7) и с объектом 40.
В нативном препарате определяют наличие лейкоцитов, эозинофилов, эритроцитов, клеток эпителия, эластических и других видов волокон и прочих элементов.
Для диагностики туберкулеза большое значение имеет обнаружение в препарате эластических волокон, присутствие которых указывает на разрушение ткани. Эластические волокна в мокроте могут быть и при других заболеваниях (например, при абсцессе легких, новообразованиях, эхинокок-козе и др.). Под микроскопом эластические волокна имеют вид длинных, блестящих волокнистых образований равномерной толщины.
При наличии каверны эластические волокна покрываются мылами и приобретают вид кораллов. Коралловидные волокна образуются при наличии в каверне жира, солей кальция и магния, образующих мыла, которые и покрывают эластические волокна. Если в мокроту добавить 10 % раствор едкой щелочи, то мыла очищаются и выявляются обычные эластические волокна.
Большое диагностическое и прогностическое значение имеет выявление в препарате так называемой тетрады Эрлиха, в которую входят следующие элементы:
- 1) обызвествленные эластические волокна,
- 2) обызвествленные частицы жирового распада,
- 3) кристаллы холестерина,
- 4) измененные микобактерии туберкулеза.
Такие элементы в мокроте наблюдаются при распаде старых обызвествленных очагов.
Методы обнаружения и выделения возбудителя туберкулеза. Наиболее надежным подтверждением диагноза туберкулеза является обнаружение возбудителя в выделениях больного или взятых из организма материалах.
Основным материалом для исследования является мокрота. При отсутствии мокроты исследуют слизь из гортани или промывные воды бронхов, иногда — промывные воды желудка. Исследованию подлежат также моча, кал, спинномозговая жидкость, экссудат из плевральной полости, ас-цитическая жидкость, пунктат из закрытых натечников. При необходимости исследуют кусочки тканей или органов, взятые у больных во время операции. Материал для исследования должен быть взят с соблюдением правил асептики.
Результаты исследований во многом зависят от правильности сбора материала, его обработки и хранения. Важное значение имеет и правильное приготовление мазков или материала для посева на питательные среды.
Для обнаружения МТ в выделениях больного применяют бактериоскопический (микроскопия мазков), бактериологический (посев материала на питательные среды) и биологический (заражение лабораторных животных) методы.
Сбор и подготовка материала для исследования.
Мокрота. Следует собирать утренние порции мокроты и исследовать ее в тот же день. Если у больного мало мокроты, то ее собирают в течение дня (суточная мокрота). Для усиления секреции мокроты применяют раздражающую аэрозольную ингаляцию, для чего используют аэрозольный ингалятор типа АИ-1. Для ингаляции рекомендуется 15 % раствор натрия хлорида в 1 % растворе натрия гидрокарбоната. Ингалируют 30—60 мл раствора, нагретого до 42—45 °С. Индивидуальные мерные стаканчики и мундштуки подлежат дезинфекции. При отсутствии мокроты у больных получают промывные воды бронхов. У детей чаще исследуют промывные воды желудка, так как они плохо откашливают мокроту и заглатывают ее.
Лучше исследование мокроты проводить до начала лечения ежедневно в течение 3 дней подряд. Объяснить больному, что он должен собирать не носоглоточную слизь и слюну, а отделяемое из верхних дыхательных путей при кашле.
Перед сбором мокроты больной должен прополоскать рот и зев кипяченой водой. Мокрота должна быть собрана в стерильную плевательницу. Промывные воды бронхов получает врач-ларинголог. Для микроскопии и посева используют осадок, полученный при центрифугировании промывных вод.
Моча. В мочу могут попасть непатогенные микобактерии смегмы, которые имеют морфологическое сходство с мико-бактериями туберкулеза. Поэтому перед взятием мочи необходим тщательный туалет наружных половых органов. Утреннюю мочу следует брать стерильным катетером в стерильную посуду. Если результат утренней порции мочи отрицателен, то 2—3 дня подряд берут суточную порцию мочи, которую отстаивают в течение ночи, верхний слой сливают, а остаток центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об/мин. Осадок используют для приготовления мазка и посева.
Кал. В хлопьях слизи и гноя можно обнаружить микобактерии туберкулеза (методом бактериоскопии и посева).
Спинномозговая жидкость. Ее оставляют на сутки при комнатной температуре. На поверхности жидкости образуется фибринозная пленка, из которой и делают мазок на стекле. При отсутствии пленки жидкость центрифугируют при 2000 об/мин в течение 30 мин, после чего ее сливают, а из осадка делают мазок.
Бактериоскопия (микроскопия) мазков. Микроскопическое исследование мазков является наиболее простым, доступным, дешевым и быстрым методом обнаружения микобактерий. Он остается одним из основных методов исследования.
Недостатком прямой бактериоскопии окрашенных мазков является низкая чувствительность метода. При микроскопии можно обнаружить М’Г в мокроте, если в 1 мл мокроты содержится не менее 10000—100000 палочек. В настоящее время под влиянием химиотерапии количество микробов в мокроте значительно снижается, что создает дополнительные трудности в выявлении возбудителя. В связи с этим в повседневной практике работы широко применяют методы обогащения и накопления микобактерий, которые позволяют концентрировать возбудителей туберкулеза в небольшом объеме материала. Совершенствуются и сами методы бактериоскопии и выделения возбудителя.
Мазки для микроскопии готовят из любого материала, полученного от больного (мокрота, кал, моча, плевральный экссудат, гной, спинномозговая жидкость).
Приготовление мазков из мокроты. Мокроту выливают в чашку Петри, под которую подкладывают лист черной бумаги, на фоне последней хорошо заметны жел-тогнойные комочки, которые и следует отбирать. Гнойные комочки деревянными заостренными палочками переносят на предметное стекло. Мазок готовят путем растирания комочков между 2 стеклами. Затем мазок высушивают на воздухе, фиксируют путем проведения мазка через пламя горелки и окрашивают по Цилю-Нильсену.
Окраска мазка по Цилю-Нильсену. На мазок наливают основной фуксин Циля и подогревают его до появления пара. После остывания мазка краску сливают и мазок промывают водопроводной водой, обесцвечивают 10—15 % раствором серной кислоты или 3 % раствором солянокислого спирта до появления бледно-розового цвета и после этого снова промывают водой. Затем мазок докрашивают 0,5 % раствором метиленового синего в течение 1/2 мин. Мазок промывают водой и высушивают.
На мазок наносят каплю кедрового масла и микроско-пируют. Микобактерии под микроскопом окрашены в рубиново-красный цвет в виде тонких прямых или слегка изогнутых палочек и располагаются единично или небольшими группами на сине-голубом фоне, в который окрашены вещество мокроты и различные клетки. При лечении химиопрепаратами микобактерии часто приобретают вид толстых и грубых палочек, похожих на кокки, и имеют более светлую окраску.
Бактериоскопия дает приблизительно на 10 % больше положительных результатов при использовании метода флотации, позволяющего в 5—10 раз увеличить концентрацию микобактерий.
Метод флотации заключается в том, что бензин, бензол, ксилол, толуол и другие углеводороды легче воды, добавленные в мокроту с водой, при встряхивании разбиваются на мельчайшие капельки, которые, поднимаясь кверху, адсорбируют на себе микобактерии.
В банку объемом 250 мл со стеклянными бусами вносят 10—15 мл мокроты (или другого исследуемого материала — кал, осадок мочи, экссудата и др.), добавляют примерно равное количество 0,5—1 % раствора едкого натра и встряхивают до полного разжижения мокроты. Затем добавляют 100 мл дистиллированной воды и 0,5—1 мл любого углеводорода и встряхивают в течение 5—10 мин. После этого в бутылку добавляют дистиллированной воды до горлышка и оставляют при комнатной температуре на 30—60 мин. На поверхности появляется беловатое пенистое флотационное кольцо, которое отсасывают пастеровской пипеткой с резиновым баллончиком и наносят на предметное стекло. По мере подсыхания капли на нее наносится новая порция. Наслаивание после подсыхания проводится 4—5 раз. После этого мазок фиксируют и окрашивают по Цилю-Нильсену.
Для концентрации возбудителя широко применяют также метод седиментации (осаждения). К мокроте прибавляют равный объем 10 % раствора натрия фосфата, который является хорошим гомогенизатором мокроты, не нарушает жизнедеятельность микобактерий и в то же время угнетает рост сопутствующей микрофлоры. После добавления натрия фосфата смесь инкубируют при температуре 37 °С в течение 24 ч, затем центрифугируют 5—10 мин при 2000 об/мин. Надосадочную жидкость потом сливают, а осадок используют как для посева, так и для микроскопии.
Более чувствительной является люминесцентная микроскопия, которая на 20—30 % по сравнению с обычной увеличивает положительный результат. Этот метод основан на способности липидов микобактерий воспринимать люминесцентные краски, которые светятся при облучении их короткими синими или ультрафиолетовыми лучами. Светящиеся микобактерии хорошо видны. Мазок можно просматривать при малом увеличении гораздо быстрее, чем при объективе с иммерсией. Мазок готовят как обычно, фиксируют смесью Никифорова и пропитывают специальными красителями (флюорохромами): аурамином в разведении 1:1000 или родамином С. Затем мазок обесцвечивают солянокислым спиртом и докрашивают кислым фуксином. Под микроскопом микобактерии светятся на темном фоне ярким золотисто-зеленым цветом. Микроскопию проводят в люминесцентном микроскопе или на обычном с опакиллюминатором (насадкой), пропускающим короткие синие и ультрафиолетовые лучи.
Недостаток метода микроскопии состоит в том, что он не позволяет безусловно дифференцировать патогенные и непатогенные микобактерии. С целью ориентировочной дифференциации патогенных и непатогенных микобактерий при микроскопии используют более длительное обесцвечивание мазков кислотой или спиртом. Сапрофиты после этого частично или полностью обесцвечиваются, а патогенные микобактерии удерживают окраску.
В последние годы появилась возможность отличать в мазках живые и мертвые микобактерии, что может служить дополнительным важным критерием оценки эффективности лечения. Суть метода состоит в том, что дезоксирибонуклеи-новая кислота (ДНК) живых микобактерий воспринимает окраску метиленовым зеленым, а у мертвых ДНК этой окраской не окрашивается. В то же время ДНК мертвых микобактерий может окрашиваться дополнительными красителями: пиронином, сафронином или карболовым фуксином.
Наиболее надежным, достоверным и чувствительным методом диагностики туберкулеза является метод выделения чистой культуры микобактерий (бактериологический). Этот метод позволяет выявить микобактерии при содержании 20—100 возбудителей в исследуемом материале, увеличивает положительный результат на 15—30 %. Выделенную культуру можно изучить, дифференцировать от непатогенных микобактерий, определить ее вирулентность и устойчивость возбудителя к лечебным препаратам. Недостатками бактериологического метода являются сложность обработки материала и длительный рост возбудителя на средах.
Засеваемый материал гомогенизируют и одновременно обрабатывают серной или соляной 6 % кислотой или 4—6 % раствором едкого натра для уничтожения посторонней микрофлоры. Осадок после центрифугирования служит материалом для посева. Посев производят на яичную среду Левенштейна-Йенсена, которая рекомендована Всемирной организацией здравоохранения в качестве стандартной среды. Посев материала делают в 5 пробирок. При обработке материала серной кислотой вся процедура подготовки для посева должна быть выполнена быстро — в пределах 15 мин, так как более длительная экспозиция в кислоте снижает способность микобактерий к росту. Микобактерии вырастают на среде на 15—25-й день после посева. Жидкие материалы (моча, ликвор, экссудат, промывные воды желудка и бронхов) перед посевом необходимо центрифугировать и для устранения посторонней микрофлоры обработать осадок 3 % раствором серной кислоты в течение 20 мин. После этого обработанный кислотой материал повторно центрифугируют, а осадок используют для посева на среду. Ликвор, полученный стерильно, засевают без обработки кислотой.
Можно делать также посев мазка из гортани. Мазок берут ватным тампоном с надгортанника под контролем гортанного зеркала. Тампон помещают в небольшой объем 3—5 % раствора серной кислоты, отжимают его, а раствор центрифугируют. Осадок засевают на среду.
Иногда пользуются ускоренными методами посевов, из которых наиболее известен метод Прайса. Этот метод состоит в том, что подсушенный мазок мокроты после обработки его в серной кислоте и промывания погружают в пробирки с кровяной средой на 7—10 дней. Затем мазок промывают, сушат, фиксируют и окрашивают по Цилю-Нильсену. Применение для обработки мокроты поверхностно-активных веществ (лаурилсульфат; лауросепт и др.) значительно увеличивает рост микобактерий.
Для посева патологического материала используют плотные, полужидкие и жидкие питательные среды, но ни одна из них не обладает всеми необходимыми качествами. Поэтому посев делают на 2—3 различные среды. Чистые культуры выделяют на плотных, полужидких яичных и агаровых средах.
В настоящее время обязательно определение устойчивости микобактерий к стрептомицину, тубазиду и ПАСКу (парааминосалициловая кислота). С этой целью готовят набор сред Левенштейна с тремя разными концентрациями каждого препарата. Микобактерии, которые растут при концентрации 10 мкг/мл и более стрептомицина и ПАСКа и при концентрации 1 мкг/мл и более тубазида, считаются лекарственно-устойчивыми.
Большое значение в микробиологической диагностике туберкулеза имеет определение количества микобактерий в исследуемом материале для оценки тяжести процесса, тактики лечения и его эффективности.
Биологический метод исследования основан на заражении патологическим материалом морских свинок, которые очень чувствительны к туберкулезной инфекции. Этот метод признается более чувствительным для обнаружения микобактерий. Появление измененных под влиянием химиотерапии микобактерий иногда дает отрицательные результаты заражения животных при положительных результатах посева на среды. Это происходит в результате значительного снижения или полной утраты микобактериями вирулентности. С целью повышения количества положительных результатов морским свинкам перед заражением ежедневно вводят большие дозы кортизона, снижающего их резистентность. Через 3—4 нед после введения исследуемого материала морской свинке ставят туберкулиновую пробу. Положительная реакция будет свидетельствовать о присутствии микобактерий туберкулеза. Если животное не погибает через 3 мес, его забивают и различные ткани подвергают микроскопическому исследованию. Для целей диагностики этот метод в настоящее время имеет ограниченное применение, поскольку посев на питательные среды дает достаточно хорошие результаты.
источник
Консультант по гематологии,
цитохимии и микробиологии
Важное место в общем комплексе клинико-лабораторных исследований, применяемых для профилактики, диагностики и лечения гнойно-воспалительных заболеваний и осложнений у больных в лечебно-профилактических учреждениях занимают микробиологические исследования. Современная клиническая медицина предъявляет к микробиологическим (бактериологическим) исследованиям возрастающие требования по увеличению объема, повышению качества исследований, разработке и внедрению новых более совершенных методов. Это связано как с новыми научными достижениями в области эпидемиологии и бактериологии, так и с увеличением гнойно-воспалительных заболеваний, ростом госпитальных инфекций.
Материалом для изучения этиологии заболеваний дыхательных путей служат: отделяемое зева и носа; мокрота; содержимое бронхов, полученное при бронхоскопии или при отсасывании через трахеостому (у больных, находящихся на аппаратном дыхании); экссудаты; резецированные ткани и др. Материал собирают с соблюдением правил асептики в предварительно простерилизованные баночки или пробирки и доставляют в лабораторию. Хранение материала способствует размножению сапрофитирующей микрофлоры, развитию процессов гниения и брожения, что искажает результаты анализа. Интервал между взятием материала и его посевом не должен превышать 1-2 часа. Самым простым методом выявления микобактерий туберкулеза в выделениях больных является микроскопия мазка, приготовленного из мокроты. При бактериоскопии мазка, окрашенного по Цилю-Нильсену, микобактерии туберкулеза могут быть обнаружены при наличии не менее 100 000 — 1 000 000 бактериальных клеток в 1 мл патологического материала (мокроты). Такое большое количество микобактерий встречается у больных с далеко зашедшими прогрессирующими формами заболевания (диссеминированными и фиброзно-кавернозными). У значительно большего числа больных количество выделяемых ими микобактерий ниже предела метода бактериоскопии.
Чувствительность метода люминесцентной микроскопии значительно выше — от 10 000 до 100 000 микобактерий в 1 мл материала, кроме того, этот метод дает возможность за значительно более короткое время просмотреть необходимое количество препаратов. Эффективность бактериоскопии повышается также при передаче изображения на компьютер при помощи присоединенной к микроскопу видеокамеры.
Чтобы диагностировать туберкулез, необходимо сделать все возможное для выявления возбудителя заболевания. Микробиологически диагноз может быть подтвержден на основе результатов культурального исследования на комплекс M. tuberculosis (или, при возможности, путем идентификации специфических последовательностей нуклеиновых кислот) в пробах, взятых в месте локализации патологического процесса. Однако на практике в настоящее время многие лаборатории не располагают материально-технической базой для проведения культуральных исследований. К счастью, микроскопия окрашенных препаратов мокроты доступна практически везде, поэтому диагностика туберкулеза может проводиться на основе выявления кислотоустойчивых микобактерий. На территориях с высокой распространенностью туберкулеза выявление кислотоустойчивых микобактерий в окрашенных препаратах мокроты демонстрирует высокую специфичность, поэтому положительный результат микроскопии мокроты можно рассматривать как подтверждение диагноза. Кроме высокой специфичности к комплексу M. tuberculosis, выявление кислотоустойчивых микобактерий при микроскопии играет важную роль по трем причинам: это – наиболее быстрый метод диагностики туберкулеза; позволяет выявить больных с тяжелым развитием патологии, чреватым высоким риском летального исхода; дает возможность выявить больных, являющихся распространителями инфекции.
Оценка качества работы лабораторий микроскопии должна проводиться соответствующим государственными органом (как правило, представителями национальной программы борьбы с туберкулезом).
Неправильный диагноз, поставленный перед началом лечения, приводит к риску ненужного, неправильного или неудачного лечения. Более того, подобный подход чреват несвоевременной постановкой правильного диагноза и назначением соответствующего лечения. При надлежащем подходе и контроле в большинстве случаев у детей в возрасте пяти лет и старше могут быть получены образцы мокроты. У подростков (хотя они часто относятся к детской возрастной группе, по крайней мере, до 15 лет) получить пробы мокроты не составляет большого труда. Поэтому фактор возраста не может рассматриваться как препятствие для сбора проб мокроты у детей и подростков.
Исходя из имеющихся данных, можно прийти к заключению, что для диагностики туберкулеза необходимо взять не менее двух проб мокроты. В случаях, когда имеются соответствующие возможности, можно направлять для лабораторного исследования еще и третью пробу, но исследование более трех проб мокроты вряд ли целесообразно, поскольку не может в значительной мере повысить эффективность диагностики. Кроме того, исследование третьей пробы может оказаться полезным только для подтверждения диагноза, если одна или две предыдущие пробы дали положительный результат. Крайне желательно, чтобы результаты микроскопии мокроты направлялись лечащему врачу в течение одного рабочего дня с момента отправки проб. Не меньшее значение имеет также и время сбора проб. Результаты исследований показывают, что эффективность лабораторных анализов максимальна, если пробы мокроты получены утром, после пробуждения от ночного сна. Возможно, совершенно необязательно собирать только утренние пробы, но, про крайней мере, одна из них должна быть получена утром.
Как правило, внелегочные очаги туберкулезного процесса содержат гораздо меньшее количество M. tuberculosis, поэтому микроскопическое выявление кислотоустойчивых микобактерий в пробах из внелегочных очагов весьма затруднено, и в таких случаях результаты культуральных исследований приобретают большое значение. Учитывая низкую результативность микроскопии, при внелегочном туберкулезе культуральные и морфологические исследования приобретают особое значение, например, в диагностическом исследовании проб ткани лимфатических узлов, полученных при помощи игловой биопсии.
Лечение пациентов, у которых наблюдаются тяжелое или быстро развивающееся заболевания, ассоциированные с туберкулезом, необходимо начинать немедленно, даже до лабораторного подтверждения диагноза. Лечение следует начинать до получения результатов лабораторного исследования и лишь позднее внести необходимые поправки и изменения в схему лечения с учетом результатов микроскопии.
Хотя микроскопия мокроты является наиболее доступным бактериологическим тестом, там, где ресурсы позволяют и имеются условия для качественной лабораторной диагностики, в диагностический алгоритм необходимо включать культуральные исследования мокроты, в случаях отрицательных результатов микроскопии. Правильное проведение культуральных исследований связано с определенными трудностями и дополнительными затратами, но этот метод отличается более высокой чувствительностью и повышает вероятность раннего выявления больных туберкулезом.
Микроскопия мазков мокроты по Циль-Нильсену является важнейшим элементом диагностики туберкулеза. Исследование 3 мазков мокроты позволяет выявить более 60% случаев туберкулеза легких и 95% наиболее заразных случаев (исследование одного мазка мокроты выявляет 75% наиболее заразных случаев, исследование второго мазка мокроты добавляет еще 20%, а исследование третьего — еще 5%).
Микроскопия мазков мокроты по Циль-Нильсену позволяет быстро получить результаты, выявить основные источники инфекции, является менее дорогостоящей, чем посев мокроты и широко доступна для применения. Но она должна быть надежной и хорошо контролироваться. Вероятность обнаружения МБТ при бактериоскопии мазков мокроты прямо пропорциональна концентрации возбудителя в исследуемом материале. Например, когда в 1 мл мокроты содержится от 1000 до 10000 МБТ, то вероятность получения положительного результата составляет около 40-50%. При концентрации МБТ менее 1000 в 1 мл мокроты вероятность их обнаружения резко снижается – отрицательные результаты получаются примерно в 96% случаев.
Основным и наиболее часто изучаемым биоматериалом в пульмонологической практике является мокрота. Требования к забору и качеству мокроты следующие:
1) первую пробу мокроты желательно получить до начала курса антибиотикотерапии;
2) мокроту оптимально собирать утром, до приема пищи, после тщательного туалета полости рта (полоскание кипяченой водой);
3) больным нужно доступно объяснить, что требуется получить именно содержимое нижних отделов дыхательных путей, а не ротоглотки, и, по возможности, проконтролировать их действия;
4) забор материала проводить в стерильные интактные контейнеры;
5) продолжительность хранения мокроты в контейнерах не должна превышать 2 ч (в летнее время желательно не более 1 ч);
6) в условиях лаборатории качество мокроты оценивается после окрашивания мазка по Граму (при наличии в мазке менее 25 лейкоцитов и более 10 эпителиальных клеток, при просмотре не менее 8-10 полей зрения при малом увеличении, мокрота признается некачественной, дальнейшее ее исследование нецелесообразно, так как, скорее всего, материал получен из ротовой полости);
7) высокая диагностическая ценность исследования признается при выделении возбудителя в концентрации і106 КОЕ/мл.
Вообще, в диагностике заболеваний туберкулезом можно выделить несколько этапов:
· Преаналитический этап (предварительный диагноз, выбор материала и метода исследования, забор биомтериала и его транспортировка)
· Аналитический этап (непосредственно проведение анализа)
· Постаналитический этап (оценка результатов)
Часть этих этапов проводится вне лаборатории, поэтому очень важна согласованная и качественная работа всех специалистов, привлеченных в этот процесс. Важен правильный выбор исследуемого материала. Важным этапом диагностики являются процедуры взятия и доставки материала в лабораторию.При взятии всех видов исследуемого материала следует ориентироваться на стандартные системы для этой цели: тампоны, цитощетки, тубсеры, контейнеры и т.п. Эффективность аналитического этапа во многом определяется уровнем технического оснащения лабораторий. Постаналитический этап исследования включает две составляющие: проверку достоверности полученного результата и оценку этиологической значимости выделенных штаммов. В лаборатории должен осуществляться строгий внутренний контроль качества исследований, важной составляющей которого является проверка полученных результатов на достоверность. Оценка этиологической значимости выделенных микроорганизмов принципиальна для выбора адекватной терапии. Процедура приготовления мазков начинается с подготовки предметных стекол. Необходимо использовать только новые, отмытые и обезжиренные в спирте или смеси для обезжиривания предметных стекол (производство АБРИС+) стекла без царапин и сколов. При повторном использовании стекла могут быть недостаточно хорошо отмыты от предыдущего материала, что может привести к получению ложноположительных результатов. Не рекомендуется использовать саморезанные стекла, которые приводят к значительным аберрациям исследуемого изображения. Стекла должны соответствовать ГОСТу. Стекла, на которых при микроскопическом исследовании были обнаружены кислотоустойчивые микобактерии, сохраняются в лаборатории в течение 1 года, а затем подлежат обязательному уничтожению и не должны использоваться повторно. Новые предметные стекла кипятят 15 минут в 1% растворе питьевой соды (10 г двууглекислого натрия на 1 л воды), промывают в 1% растворе соляной кислоты (к 1 л воды добавляют 10 мл концентрированной соляной кислоты), а затем промывают в проточной воде и протирают насухо.
Для обезжиривания вымытые и высушенные стекла помещают в герметически закрытые емкости со смесью для обезжиривания. Стекла должны подвергаться обезжириванию в течение суток. Непосредственно перед приготовлением мазков стекла повторно протираются насухо. Для окраски мазков, приготовленных непосредственно из диагностического материала (метод прямой микроскопии), наиболее часто используется метод Ziehl-Neelsen (Циль-Нильсен) (Реагенты — «Диахим» — набор для окраски по Циль-Нильсену»)..
источник
1. Изучение мазков из мокроты больного туберкулезом(зарисовать)
В мазке, окрашенном по Цилю-Нильсену, на синем фоне видны окрашенные в ало-красный цвет туберкулезные бактерии в виде тонких, прямых или слегка изогнутых палочек, часто зернистых, расположенных поодиночке или небольшими кучками. Синий цвет имеют лейкоциты, слизь, другая микробная флора мокроты.
2. Изучение роста микобактерии на среде Левенштейна-Йенсена(зарисовать)
Вирулентные культуры микобактерий туберкулеза растут на плотной среде в виде R-колоний. Колонии сухие, морщинистые, кремового цвета с чуть приподнятым центром и изрезанным краем. Средняя продолжительность роста 20–46 дней, поэтому посевы выдерживают в термостате в течение 2–3 месяцев, для предотвращения высыхания среды ватные пробки заливают смесью воска (1/3) с парафином (2/3).
3. Изучение бактериологической диагностики туберкулеза по схеме (записать схему диагностики в тетрадь)
Лаборатория противотуберкулезной службы должна быть готова получить любой биологический материал на исследование туберкулеза (мокрота, отделяемое верхних дыхательных путей, полученное после аэрозольной ингаляции, промывные воды бронхов, бронхоальвеолярные смывы (БАС), бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ), транстрахеальный биоптат, внутрилегочный биоптат, аспират из бронхов, мазки из гортани, экссудат, промывные воды желудка, моча, спинномозговая жидкость, плевральная жидкость, перикардиальная жидкость, синовиальная жидкость, асцитическая жидкость, материал, полученный при бронхоскопии, кровь, гной, гнойно-некротические массы, пунктат костного мозга, резецированная ткань, грануляции, соскоб синовиальных оболочек, лимфатические узлы или их пунктат).
При проведении бактериологического исследования необходимо учитывать, как собран материал. Материал может быть собран как в асептических, так и в антисептических условиях. Асептически собранный материал, как правило, не содержит другую микрофлору. Биологические жидкости (ликвор, перикардиальная, синовиальная, асцитическая, кровь, костный мозг) должны собираться врачом в асептических условиях в стерильный контейнер с использованием соответствующих методик. К жидкостям, имеющим склонность к свертыванию, добавляются стерильные гепарин (0,2 мг на мл) или оксалат калия (0,01–0,02 мл 10% нейтрального оксалата на 1 мл материала).
Материал должен доставляться в лабораторию немедленно. Асептически собранные ткани помещаются в стерильные контейнеры без добавления каких-либо консервантов. В случае длительной транспортировки ткани необходимо поместить в стерильный физраствор, обложить сухим льдом или охладить при температуре 4-15 °С. Следует немедленно доставлять материал в лабораторию.
Моча (средняя часть утренней порции или вся утренняя порция) собирается в стерильную посуду после тщательного туалета наружных половых органов. Анализ мочи на микобактерии должен предусматривать обязательное троекратное исследование. Особенностью существования M.Tuberculosis в жидкостях является способность их долгое время находиться во взвешенном состоянии. В связи с этим рекомендуется производить центрифугирование при 3000 g всего материала, а не его донной фракции, получаемой после отстаивания в естественных условиях. Сбор суточной мочи для бактериологического исследования не практикуется.
При накоплении мочи в течение суток невозможно сохранить ее стерильность. Хранение емкости с мочой в холодном месте может привести к выпадению солей, что неблагоприятно отражается на последующей обработке осадка. Кроме того, в моче содержатся бактерицидные продукты (фенол), которые могут не только угнетать жизнеспособность микобактерий, но в течение суток даже разрушать микробные клетки. В то же время при длительном хранении мочи невозможно избежать размножения в ней гнилостной и гноеродной микрофлоры. Установлено, что при хранении мочи более 1 часа после ее сбора число микробных клеток неспецифической гноеродной и гнилостной микрофлоры увеличивается в несколько раз. Ферменты жизнедеятельности этой флоры могут угнетать способность микобактерий к росту. И наконец, следует иметь в виду возможность попадания в нее кислотоустойчивых сапрофитов, что может привести к диагностическим ошибкам. В лаборатории мочу центрифугируют, используя метод накопления осадка.
Чаще всего для диагностики туберкулеза исследуется мокрота больного. У больного с продуктивным кашлем получение мокроты не представляет трудностей. В случае, если больной не может откашлять мокроту, можно использовать другие методы.
Сбор мокроты для исследования на микобактерии туберкулеза – весьма ответственный этап диагностической процедуры, от четкости проведения которого во многом зависит результат исследования.
Необходимо иметь в виду, что в момент откашливания больным мокроты создается очень высокий риск воздушно-капельного распространения инфекции. В связи с этим желательно, чтобы сбор мокроты производился в специально выделенном для этих целей отдельном, хорошо вентилируемом помещении (пункте сбора мокроты), оснащенном бактерицидными лампами и средствами дезинфекции, или на открытом воздухе. Идеальным вариантом является установка в комнате для сбора мокроты специальной кабины для сбора мокроты с интенсивной вытяжной вентиляцией.
Сбор мокроты должен производиться в присутствии и при непосредственном участии медицинского работника. Лицам, ответственным за сбор мокроты, необходимо руководствоваться правилами.
Так, надо объяснить больному причины исследования и необходимость откашливать не слюну или носоглоточную слизь, а содержимое глубоких отделов дыхательных путей, что достигается в результате продуктивного кашля, возникающего после нескольких (2–3) глубоких вдохов. Необходимо также предупредить больного, что он должен предварительно прополоскать полость рта кипяченой водой, что позволяет механически удалить основную часть вегетирующей в ротовой полости микрофлоры и остатки пищи, загрязняющие мокроту и затрудняющие ее обработку. Участвующий в сборе мокроты медицинский работник помимо халата и шапочки должен быть в маске-респираторе, резиновых перчатках и резиновом фартуке. Он должен находиться за спиной больного, выбирая свое положение таким образом, чтобы направление движения воздуха было от него – к больному.
Для сбора диагностического материала должны использоваться специальные контейнеры. Медицинский работник должен открыть контейнер для сбора мокроты, снять с него крышку и передать больному донную часть контейнера. Наилучшим вариантом является использование для сбора диагностического материала одноразовых пластиковых прозрачных контейнеров объемом около 50-100 мл. Контейнерыизготовлены из ударостойкого и прозрачного материала, не допускающего просачивания жидкости. Материал, из которого изготовлен такой контейнер, должен расплавляться (деформироваться) при автоклавировании (при 121 °С). Контейнеры должны легко подвергаться маркировке. Надежно сохранять мокроту на всем протяжении периода хранения, транспортировки и проведения исследования. Иметь завинчивающиеся крышки с уплотнением (исключить плотно закупоривающие флакон крышки: при открытии таких крышек в контейнере возникает разряженное пространство, которое приводит к образованию аэрозоля, создавая потенциальную опасность внутрилабораторного заражения). Контейнеры должны иметь широкое отверстие для сбора мокроты (не менее 30 мм в диаметре), чтобы пациент мог легко отделять мокроту внутрь контейнера, не подвергая загрязнению его наружную поверхность. Использование таких контейнеров позволяет легко оценить качество и объем собранного материала, а при приготовлении мазков из нативной мокроты – проводить выбор гнойных комочков для приготовления мазка непосредственно из контейнера, избегая чрезвычайно опасного из-за образования аэрозоля этапа выливания мокроты в чашку Петри.
По завершении процедуры сбора мокроты медицинский работник должен закрыть контейнер крышкой (или проверить, насколько плотно его закрыл пациент) и оценить количество и качество собранной мокроты.
Если мокроту получить не удалось, контейнер считается использованным и подлежит обеззараживанию.
Контейнер с порцией мокроты достаточного объема (не менее 3-5 мл), содержащей уплотненные или гнойные комочки без слюны, тщательно закрывают завинчивающейся крышкой, затем контейнер маркируют и помещают в специальный бикс для транспортировки в лабораторию.
В целях повышения высеваемости микобактерий время между сбором материала и обработкой должно быть минимальным. Материал сразу после сбора следует отправлять в лабораторию (в течение 24 часов). В случае удаленности лаборатории от места взятия материала его отправка в лабораторию может осуществляться два раза в неделю. В этом случае контейнеры с собранным материалом должны храниться в холодильнике при температуре 4–8 °С не более 72 часов. При хранении более 72 часов к диагностическому материалу добавляется консервант, в этом случае срок хранения увеличивается до 5 суток. Асептический материал должен отправляться в лабораторию немедленно!
В случаях других материалов, если предполагается их транспортировка при высокой температуре окружающей среды или их доставка в лабораторию более чем через 24–72 часа после сбора (взятия), рекомендуется использовать химические консерванты (если предполагаемая задержка не превышает 24 часа, материал смешивают с равным объемом 10% раствора трехзамещенного фосфата натрия). Для безопасной транспортировки патологический материал должен быть упакован в водонепроницаемую и небьющуюся емкость, защищенную от сотрясений, ударов и других возможных воздействий.
Подавляющее большинство материала, отправляемого в лабораторию, направляется в нее в единообразных контейнерах, применяемых для сбора мокроты, поэтому целесообразно иметь в лаборатории несколько специальных металлических или пластиковых транспортировочных ящиков. Они устроены таким образом, чтобы фиксировать 20–30 контейнеров с диагностическим материалом в вертикальном положении.
С каждым ящиком/биксом следует сопроводительный лист, в который из регистрационного журнала медицинского учреждения переносятся данные о пациентах. Направления и сопроводительный лист должны содержаться отдельно от материала (в полиэтиленовом пакете, вне бикса). Сопроводительный лист составляется в 2 экземплярах: один заполненный экземпляр оставляется в лаборатории; другой – с подписью сотрудника, принявшего материал для исследования, возвращается в учреждение, направившее материал в лабораторию. На втором экземпляре сопроводительного листа, который должен быть возвращен в ЛПУ отправителю, вписываются: наименование ЛПУ-получателя, фамилия и инициалы лица, принявшего материал и дата получения материала. Перед отправкой собранного материала медицинский работник должен проверить:
1) соответствует ли количество контейнеров с мокротой их количеству, указанному в сопроводительном списке;
2) соответствует ли номер каждого контейнера номеру, указанному в списке;
3) имеются ли в списке все необходимые данные о каждом пациенте.
После проверки в сопроводительном списке медработник:
1) указывает дату отправки материала на исследование и ставит свою подпись;
2) вкладывает в конверт сопроводительный список и заполненные бланки направлений на микроскопическое исследование на каждую пробу материала и прикрепляет конверт к биксу снаружи;
3) тщательно закрывает бикс.
Материал, поступающий в микробиологическую лабораторию, для культурального исследования с целью диагностики и контроля химиотерапии туберкулеза, в различной степени загрязнен быстрорастущими бактериями, рост которых на богатых питательных средах мешает развитию микобактерий и затрудняет их выделение. В связи с этим перед посевом на питательную среду диагностический материал подвергают специальной обработке, обеспечивающей деконтаминацию, то есть гибель гноеродной и гнилостной микрофлоры. Кроме того, микобактерии туберкулеза, выделяющиеся из дыхательных путей больного, как правило, окружены большим количеством слизистых веществ, затрудняющих их выделение. Поэтому мокроту и другие сходные материалы перед посевом одновременно с деконтаминацией подвергают разжижению и гомогенизации. Все препараты, используемые в настоящее время для разжижения и деконтаминации диагностического материала, обладают более или менее выраженной токсичностью в отношении микобактерий.
80Все реактивы, используемые при приготовлении растворов для обработки материала, должны иметь степень очистки не менее категории «химически чистый» (ХЧ). Для предпосевной обработки диагностического материала рекомендуется использовать трехзамещенный фосфорнокислый натрий (Na3PO4), который хорошо подавляет сопутствующую флору и даже при 2–3-дневном хранении материала при +4 °С не повреждает микобактерии и мало влияет на их способность к росту на питательных средах.
Для обработки мочи, гнойных экссудатов и отделяемого ран, резецированных тканей, органов экспериментальных животных и пр. используют серную кислоту. Микобактерии туберкулеза не теряют жизнеспособности в сильно закисленной среде, однако необходимо помнить, что длительная экспозиция материала в растворе серной кислоты губительно действует на микобактерии. Поэтому кислотой производят обработку материала, содержащего большое количество сопутствующей микрофлоры. Обработка кислотой не должна превышать 20 мин!
Обработка с помощью NaOH является достаточно жесткой и может приводить к гибели до 60% микобактерий, содержащихся в исследуемом образце материала. Данный показатель не зависит от дополнительной гибели бактерий за счет повышенной температуры при центрифугировании и других факторов. Гидроокись натрия токсична по отношению, как к загрязняющим микроорганизмам, так и к микобактериям туберкулеза. Поэтому при использовании щелочи необходимо строго соблюдать время обработки. Общее время обработки материала щелочью не должно превышать 40 мин!
В клиниках с достаточными материальными ресурсами могут применяться более дорогие методы гомогенизации и деконтаминации, например, метод с использованием NALC-NaOН (N- ацетил-L-цистеина). Применение муколитического препарата NALC, используемого для быстрого разжижения мокроты, позволяет ускорить процесс деконтаминации и снизить концентрацию деконтаминирующего вещества (NaOH) до 1%. NALK быстро теряет свою активность в растворенном виде, поэтому его раствор должен готовиться ежедневно и употребляться свежим. Иногда лабораторным работникам приходится сталкиваться с чрезмерно высокой контаминацией проб. Это создает большие сложности в работе. В таких случаях можно применить более жесткие методы деконтаминации с использованием 5% щавелевой кислоты или 4–6% серной кислоты. Эти методы нередко дают хорошие результаты в тех случаях, когда пробы мокроты оказываются массивно загрязненными Pseudomonas sp. и другими грамотрицательными микроорганизмами.
Спинномозговая, синовиальная и другие жидкости из закрытых полостей; костный мозг; гной из «холодных» абсцессов; резецированные ткани (за исключением материала аутопсии); пунктаты печени и лимфатических узлов, а также материалы биопсий (при отсутствии свища), если они были взяты в стерильные флаконы с соблюдением правил асептики, не нуждаются в деконтаминации.
Для посева диагностического материала используют разнообразные питательные среды, среди которых можно выделить 3 основные группы:
— плотные питательные среды на яичной основе;
— плотные или полужидкие питательные среды на агаровой основе;
— жидкие синтетические и полусинтетические питательные среды (пробирки BBL MGIT с модифицированной средой Миддлбрука 7Н9; флаконы BACTEC 9000МВ Myco/F Lytic для посева крови; флаконы MB Blood-BacT Alert 3D для посевов крови).
Среды имеет свои преимущества и недостатки. Оптимальная среда для культивирования МБТ должна быть недорогой, простой в приготовлении, состоять из широко доступных компонентов. Кроме того, среда должна подавлять рост сопутствующей микрофлоры, обеспечивать хороший рост при засеве небольшого количества микобактерий и возможность предварительной дифференциации выросших колоний по морфологическим признакам. Яичные среды в наибольшей степени соответствуют вышеперечисленным требованиям при проведении посева из мокроты.
В результате многочисленных сравнительных испытаний установлено, что для культуральной диагностики туберкулеза следует использовать, как минимум, две разные по составу питательные среды. Наиболее широкое распространение получил набор из 2 яичных сред – Левенштейна-Йенсена и Финна-II.
Среда Левенштейна-Йенсена применяется во всем мире в качестве стандартной среды для первичного выделения возбудителя туберкулеза и определения его лекарственной чувствительности. Эта среда рекомендуется для использования во всех микробиологических лабораториях противотуберкулезной службы Российской Федерации для получения сравнимых результатов.
Среда Левенштейна-Йенсена – это плотная яичная среда, на которой хороший рост микобактерий туберкулеза получают приблизительно на 18–25-й день после посева микроскопически положительного материала. В состав этой питательной среды входит глицерин, который способствует росту M. tuberculosis. Для выделения M. bovis рекомендуется вариант среды Левенштейна-Йенсена, в состав которой вместо глицерина входит 0,5% раствор пирувата натрия.
Среда Финна-II рекомендована в России как вторая стандартная среда для выделения микобактерий. Она отличается от среды Левенштейна-Йенсена тем, что вместо L-аспарагина в ней используется глутаминовокислый натрий (глутамат натрия) и подбор солей рассчитан таким образом, что конечная кислотность среды имеет более низкое значение (рН = 6,3–6,5), чем кислотность среды Левенштейна-Йенсена (рН = 7,2–7,4), и большую стабильность. Эти свойства обуславливают более высокую эффективность среды при засеве материала, обработанного щелочными детергентами. Рост микобактерий появляется на этой среде на несколько дней раньше, чем на среде Левенштейна-Йенсена, а процент выделения культур на 6–8% выше.
В повседневной работе микробиологической лаборатории наряду с плотными питательными средами используются и жидкие. Наиболее широко распространенной и хорошо зарекомендовавшей себя в России жидкой питательной средой является среда Школьниковой.
Перед процедурой посева необходимо подготовить пробирки с питательными средами, пронумеровать их, согласно регистрационным номерам анализов, и последовательно расположить в вертикальном штативе. Аналогичным образом подготовить и пронумеровать предметные стекла.
Осадок, полученный после предварительной обработки диагностического материала одним из вышеуказанных методов, следует подвергнуть параллельному культуральному и микроскопическому исследованиям в следующем порядке:
1. Набрать стерильной мерной (предпочтительно одноразовой пластиковой) или пастеровской пипеткой 1,0–1,2 мл подготовленного осадка, оставив приблизительно 0,1–0,2 мл для последующего приготовления мазка для микроскопии. Соблюдая условия стерильности, внести равные объемы набранного материала (примерно по 0,5–0,6 мл) в 2 пробирки с разными плотными питательными средами. Пробирки с питательной средой при посеве должны находиться в наклонном положении (под углом 40–45°). Посевной материал нанести на верхнюю треть косяка питательной среды. Засеянные пробирки закрыть ватно-марлевыми пробками и поместить в вертикальном положении в штатив таким образом, чтобы посевной материал равномерно распределился по всей поверхности косяка питательной среды.
2. На пронумерованное предметное стекло нанести 2–3 капли осадка для получения мазка для микроскопического исследования, распределив материал равномерным слоем в центре стекла на площади примерно 1–2 см. По завершении посева всех проб засеянные пробирки переместить в горизонтальные штативы и поместить в термостат при температуре 37 °С. При этом поверхность косяка питательной среды должна находиться в горизонтальной плоскости, а наклон штатива должен исключить смачивание пробки материалом засева.
3. Инкубация микобактерий туберкулеза требует длительного срока для получения видимого роста колоний. Длительный срок инкубации диктует необходимость соблюдения ряда правил для сохранения жизнеспособности клеток и ростовых свойств питательной среды. Температура инкубации: 37 °С. При первичном посеве микроскопически отрицательного материала средняя продолжительность роста микобактерий на плотных питательных средах может составить 20-46 дней. Рост отдельных штаммов появляется через 60 и даже более дней. Это обуславливает необходимость при отсутствии роста микобактерий для выдачи отрицательного результата выдерживать посевы в термостате до 10 недель. По истечении первых 2–3 суток инкубации ватно-марлевые или дренированные силиконовые пробки заменяют герметичными пробками (силиконовыми или резиновыми);
3. Пробирки переводят в вертикальное положение; инкубацию проводят в течение 10 недель при обязательном еженедельном про-
смотре засеянных пробирок.
Вирулентные культуры микобактерий туберкулеза обычно растут на плотных питательных средах в виде R-колоний различной величины и вида, имеют желтоватый или слегка кремовый оттенок (цвет слоновой кости), шероховатую поверхность, напоминающую манную крупу или цветную капусту. Колонии, как правило, сухие, морщинистые, но в случае диссоциации могут встречаться и влажные, слегка пигментированные колонии, розовато-желтый пигмент которых резко отличается от оранжевого или желтого пигмента сапрофитных или некоторых нетуберкулезных микобактерий. Последние обычно растут в S-форме. На среде Финна колонии часто выглядят более влажными, чем на среде Левенштейна-Йенсена. После курса химиотерапии от больных туберкулезом могут выделяться гладкие колонии с влажным ростом (S-формы). При приготовлении мазков для микроскопического исследования колонии микобактерий туберкулеза проявляют свои физико-химические особенности. Они не эмульгируются в изотоническом растворе, а образуют зернистую крошковидную суспензию.
При микроскопическом исследовании мазков из выросших колоний, окрашенных по Цилю-Нильсену, обнаруживаются яркие малиново-красные палочковидные бактерии, лежащие одиночно или группами.При культивировании на жидких средах или в условиях повышенной влажности M. Tuberculosis образуют скопления или переплетения в виде войлока или кос-феномен «корд-фактора». Микобактерии туберкулеза выглядят как тонкие, прямые или слегка изогнутые палочки длиной 1–10 (чаще 1–4) мкм, шириной 0,2–0,6 мкм, гомогенные или зернистые с незначительно закругленными концами.
Часто в препарате, особенно в длительно растущих культурах, видны скопления темно-окрашенных зерен. В молодых культурах, особенно выделенных от больных, длительно леченных противотуберкулезными препаратами, микобактерии отличаются большим полиморфизмом, вплоть до появления коротких, почти кокковидных форм.
Если морфология колоний или микобактерий вызывает сомнения в их принадлежности к роду Mycobacterium или культуры выделены из материала, который может содержать кислотоустойчивые сапрофиты (моча, гной из ушей и др.), мазки дополнительно обесцвечивают 3% солянокислым спиртом в течение 40–45 минут. Следует учитывать, что молодые культуры микобактерий туберкулеза могут сравнительно легко обесцвечиваться спиртом, так как они обладают слабой кислотоустойчивостью. В таких случаях культуры следует выдержать в термостате еще 5–10 дней и вновь повторить микроскопическое исследование, чтобы убедиться в их тинкториальных свойствах. Нетуберкулезные и авирулентные сапрофитные микобактерии могут варьировать по форме колоний и морфологии клеток. Колонии кремового цвета М. fortuitum, M. chelonae, М. kansasii и М. terrae complex бывают сухие и морщинистые, поэтому их иногда ошибочно принимают за МБТ. Окраска колоний НТМБ может быть от белого, телесного и кремового цвета до слабо-желтого, желтого и оранжевого. Рост культуры НТМБ может быть пышным или стелющимся, выпотевающим – дисгоническим. Некоторые из них грубее, толще, иногда менее интенсивно окрашены, и они редко образуют жгутообразные скопления (корд-фактор, как правило, отсутствует). Однако некоторые виды нетуберкулезных микобактерий (фотохромогенные) могут расти в виде характерной для микобактерий туберкулеза R-форме. Многие нетуберкулезные и сапрофитные микобактерии имеют кислотоустойчивые зерна, весьма сходные по морфологии с таковыми у вирулентных микобактерий туберкулеза. Группа родственных микроорганизмов (нокардии, родококки и др.) отличается частичной или слабой кислотоустойчивостью. В мазке можно одновременно встретить красные и синие палочки или фиолетово-синие коккобациллы. Морфологически в мазке из культуры они представлены в виде мицелия, фрагментирующегося на палочки, или крупных полиморфных палочек (таблица). Для дифференциации рода микобактерий и родственных таксонов кроме вышеописанного теста дополнительно можно использовать окраску мазка по методу Грама. Нокардии, родококки и коринебактерии хорошо воспринимают окраску по Граму – грамположительные. На основании тинкториально-морфологических свойств и скорости роста проводится определение рода выделенной культуры. У родственных микроорганизмов отмечается слабая или частичная кислотоустойчивость, быстрый рост на простых и яичных средах, выраженная окраска по методу Грама и значительный полиморфизм при микроскопическом исследовании мазка. Нокардии и родококки не имеют важного клинического значения и могут изучаться в научных лабораториях.
4. Окончательное заключение о принадлежности выделенной культуры к комплексу M. tuberculosisможно сделать только после проведения первичной дифференциации культуры, выполняемой в ходе постановки теста на лекарственную чувствительность микобактерий туберкулеза. При необходимости проводится дальнейшая идентификация выделенной культуры, позволяющая отнести микобактерии к тому или иному виду.
При оценке результатов культурального исследования диагностического материала необходимо соблюдать следующие правила.
1. Наблюдение за посевами и просмотр засеянных пробирок следует проводить еженедельно.
2. При отсутствии роста посевы должны выдерживаться в термостате в течение 10 недель. Отрицательный результат культурального исследования может быть выдан только по истечении этого срока инкубации.
3. Во время очередного просмотра следует отбирать все пробирки, в которых имеется рост колоний, расставляя их по порядку номеров регистрации материала.
4. При оценке результатов регистрировать следующие параметры:
— «появление роста» – дату появления роста в пробирках (в том случае, если рост появляется одновременно в обеих пробирках). Если культура выросла только в одной из пробирок (при этом имеется хороший рост культуры в соответствующие сроки), а во второй рост отсутствует, рекомендуется зарегистрировать дату появления роста и показатель роста в пробирке с выросшей культурой и использовать ее для дальнейшей работы, не дожидаясь появления роста колоний в другой пробирке. Вторую пробирку оставляют в термостате для дальнейшей инкубации и при наличии в ней роста в дальнейшем регистрируют полученные результаты;
— «интенсивность роста» – число колоний, выросших в каждой из пробирок. При наличии одновременного роста во всех пробирках рекомендуется оценить суммарное число колониеобразующих единиц (КОЕ) во всех пробирках, засеянных данным материалом. Этот показатель имеет важное диагностическое и прогностическое значение, особенно если посевы производятся в динамике наблюдения за больным в процессе химиотерапии;
— «загрязнение посева» посторонней микрофлорой или грибами («пророст»), при наличии такового;
— «отсутствие роста» (указанный параметр регистрируется через 10 недель культивирования).
Соблюдение указанных правил позволяет, своевременно осуществлять первичную идентификацию микобактерий. При этом необходимо иметь в виду следующие показатели:
— появление роста кислотоустойчивых микобактерий в течение 7–10 дней культивирования на плотных питательных средах может свидетельствовать о выделении быстрорастущих нетуберкулезных микобактерий, которые не относятся к комплексу M. tuberculosis. Поэтому перед выдачей ответа такие культуры должны подвергнуться первичной идентификации.
— появление роста кислотоустойчивых микобактерий после 3–4 недель культивирования свидетельствует о выделении M. tuberculosis, а также других медленнорастущих микобактерий, которые могут относиться к потенциально патогенным нетуберкулезным микобактериям или к безвредным кислотоустойчивым сапрофитам. Прежде чем дать отрицательный ответ после 10 недель культивирования, необходимо убедиться в отсутствии роста очень медленно растущих микобактерий, в числе которых могут быть и M. tuberculosis.
В ряде случаев некоторые микроорганизмы, загрязняющие посевы, обладают способностью разлагать составные ингредиенты среды с образованием кислоты. Это приводит к снижению pH-среды. На такой среде микобактерии не растут, и такие пробирки подлежат удалению. Посевы с частичным загрязнением желательно выдержать до окончания срока инкубации или до развития хотя бы нескольких колоний микобактерий, так как позднее появление загрязнения не исключает роста M. tuberculosis. В таких случаях необходимо сделать мазок, окрасить его по методу Циля-Нильсена и при наличии кислотоустойчивых микобактерий попытаться обработать выросшую культуру 3–4% раствором серной кислоты, а после отмывания ее изотоническим раствором хлористого натрия вновь засеять осадок на питательные среды.
Родовая идентификация микобактерий и первичная идентификация комплекса M. tuberculosis должны проводитьсяв бактериологических лабораториях на основании скорости роста бактерий, морфологии и окраски колоний, результатов исследования мазков, приготовленных из выделенной культуры и окрашенных по Цилю-Нильсену. Делается заключение о принадлежности культуры к комплексу микобактерий туберкулеза (МБТ). Главной отличительной особенностью рода микобактерий является строгая кислото-, щелоче- и спиртоустойчивость. Характеристика микобактерий и родственных таксонов представлена в таблице 21.,
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
источник