Капиллярный электрофорез для определения аминокислот

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КОРМА, КОМБИКОРМА, КОМБИКОРМОВОЕ СЫРЬЕ

Определение протеиногенных аминокислот методом капиллярного электрофореза

Feedstuffs, compound feeds, feed raw materials. Determination of proteinogenic amino acids using capillary electrophoresis

1 РАЗРАБОТАН Открытым акционерным обществом «Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности» (ОАО «ВНИИКП»), Обществом с ограниченной ответственностью «ЛЮМЭКС-МАРКЕТИНГ» (ООО «ЛЮМЭКС-МАРКЕТИНГ»)

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 004 «Комбикорма, белково-витаминно-минеральные концентраты, премиксы»

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 06 сентября 2013 г. N 841-ст

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Правила применения настоящего стандарта установлены в ГОСТ Р 1.0-2012 (раздел 8). Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе «Национальные стандарты», а официальный текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске информационного указателя «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (gost.ru)

Настоящий стандарт распространяется на корма, комбикорма и комбикормовое сырье и устанавливает метод определения массовой доли протеиногенных аминокислот в форме фенилизотиокарбамильных производных (далее — ФТК-производных) с помощью капиллярного электрофореза.

Методика измерений позволяет определять общее содержание (свободные и связанные формы в сумме) отдельных аминокислот в пробах. Поскольку в процессе разложения проб аспарагин и глутамин количественно гидролизуются до аспарагиновой и глутаминовой кислот соответственно, то данные по содержанию аспарагиновой и глутаминовой кислот представляют собой суммарное содержание этих кислот и соответствующих амидов. В условиях проведения измерений лейцин и изолейцин не разделяются, поэтому предусмотрено их суммарное определение.

Стандарт позволяет определять содержание аминокислот в следующих диапазонах измерений:

— аспарагиновая кислота и аспарагин в сумме (Asp, Asn) от 0,5 до 10,0 включ., %

— глутаминовая кислота и глутамин в сумме (Glu, Gln) от 0,5 до 10,0 включ., %

— лейцин и изолейцин в сумме (Leu, IIе) от 0,25 до 10,0 включ., %

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.2.007.0-75 Система стандартов безопасности труда. Изделия электротехнические. Общие требования безопасности

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 84-76 Реактивы. Натрий углекислый 10-водный. Технические условия

ГОСТ 177-88 Водорода перекись. Технические условия

ГОСТ 245-76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 4172-76 Реактивы. Натрий фосфорно-кислый двузамещенный 12-водный. Технические условия

ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 4461-77 Реактивы. Кислота азотная. Технические условия

ГОСТ 5848-73 Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 9805-84 Спирт изопропиловый. Технические условия

ГОСТ 13586.3-83 Зерно. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 13979.0-86 Жмыхи, шроты и горчичный порошок. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 17681-82 Мука животного происхождения. Методы испытаний

ГОСТ 19908-90 Тигли, чаши, стаканы, колбы, воронки, пробирки и наконечники из прозрачного кварцевого стекла. Общие технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 27668-88 Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб

ГОСТ 28311-89 Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ Р 12.1.019-2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ГОСТ Р ИСО 6497-2011 Корма для животных. Отбор проб

ГОСТ Р ИСО 7886-1-2009 Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования

ГОСТ Р 51419-99 (ИСО 6498-98) Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Подготовка испытуемых проб

ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с учетом всех внесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применять без учета данного изменения. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссылку.

Сущность метода заключается в разложении пробы для анализа кислотным гидролизом с переводом аминокислот в свободные формы, получении ФТК-производных аминокислот, дальнейшем их разделении и количественном определении методом капиллярного электрофореза.

Метод предусматривает две схемы испытаний (см. 7.1), которые различаются процедурой подготовки пробы, условиями электрофоретического определения и перечнем определяемых аминокислот.

4.1 При выполнении испытаний необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроприборами по ГОСТ Р 12.1.019 и ГОСТ 12.2.007.0, а также требования, изложенные в технической документации на используемые приборы.

4.2 Работа с химическими реактивами должна проводиться в вытяжном шкафу.

4.3 Помещение должно быть оснащено вентиляционными системами по ГОСТ 12.4.021, средствами пожаротушения по ГОСТ 12.4.009 и соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004.

4.4 Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать допустимых значений по ГОСТ 12.1.005.

5.1.1 Система (анализатор) капиллярного электрофореза (далее — прибор) с источником высокого напряжения положительной полярности, оснащенная кварцевым капилляром длиной 75 см и внутренним диаметром 50 мкм, фотометрическим или спектрофотометрическим детектором, позволяющим проводить измерения при длине волны от 250 до 260 нм, и компьютером со специальным программным обеспечением для регистрации и обработки электрофореграмм, например, система капиллярного электрофореза «Капель» с программным обеспечением «Эльфоран», в Государственном реестре средств измерений зарегистрирована за N 17727-06*.
_______________
* Информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не содержит обязательств применять оборудование данной марки.

5.1.2 Весы, обеспечивающие точность взвешивания с пределом допускаемой абсолютной погрешности не более ±0,1 мг по ГОСТ Р 53228.

5.1.3 Колбы мерные 2(2а)-25(50, 100)-2 по ГОСТ 1770.

5.1.4 Пипетки градуированные 1(2, 3, 5)-1(1а, 2, 2а)-2-5(10) по ГОСТ 29227.

5.1.6 Цилиндры мерные 1(2)-25(250) по ГОСТ 1770.

5.1.7 рН-метр лабораторный (абсолютная погрешность измерения не более ±0,05 единиц рН).

Примечания

1 Средства измерений должны быть поверены в установленные сроки.

2 Допускается использование других средств измерений, имеющих аналогичные или лучшие метрологические характеристики.

5.2 Вспомогательные устройства и материалы

5.2.1 Дистиллятор или аппарат для перегонки воды (кварцевый или стеклянный).

5.2.2 Центрифуга лабораторная с частотой вращения не менее 5000 об/мин.

5.2.3 Шкаф сушильный с рабочей температурой не ниже 150 °С и точностью поддержания температуры не более ±2 °С.

5.2.4 Холодильник бытовой — по ГОСТ 16317.

5.2.5 Вентилятор бытовой, обеспечивающий поток теплого воздуха.

5.2.10 Стаканчики для взвешивания СВ-14/8(19/9) — по ГОСТ 25336.

5.2.11 Кварцевые чаши 20 (40, 50) по ГОСТ 19908 или выпарительные чашки 1 (2) по ГОСТ 9147.

5.2.12 Стаканы В-1(2)-250 (500)-ТХС по ГОСТ 25336.

5.2.13 Баня водяная с регулятором нагрева.

5.2.14 Электроплитка бытовая — по ГОСТ 14919.

5.2.16 Фильтры обеззоленные «синяя лента».

5.2.17 Оправа для фильтра, например, производства фирмы «Sartorius Stedim»* с целлюлозно-ацетатными фильтрами (размер пор 0,2 мкм, диаметр 25 мм) или шприцевые одноразовые фильтры (размер пор 0,2 мкм, диаметр 25 мм, ацетат целлюлозы), например, «Minisart» производства фирмы «Sartorius Stedim»*.
_______________
* Информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не содержит обязательств применять оборудование и материалы только данной фирмы.

5.3.1 Вода дистиллированная — по ГОСТ 6709.

5.3.2 Гидроокись натрия — по ГОСТ 4328, х.ч.

5.3.3 Соляная кислота — по ГОСТ 3118, х.ч.

5.3.4 Спирт изопропиловый (2-пропанол) — по ГОСТ 9805, абсолютизированный.

5.3.5 Натрий углекислый 10-водный — по ГОСТ 84, х.ч.

5.3.6 Натрий фосфорно-кислый двузамещенный 12-водный — по ГОСТ 4172, х.ч.

5.3.7 Натрий фосфорно-кислый однозамещенный 2-водный — по ГОСТ 245 или моногидрат, ч.д.а.

5.3.8 Муравьиная кислота — по ГОСТ 5848, ч.д.а.

5.3.9 Пероксид водорода — по ГОСТ 177, 30%, медицинский.

5.3.10 Набор L-аминокислот, например, набор LAA-21 производства фирмы «Sigma»*.
_______________
* Информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не содержит обязательств применять оборудование и материалы только данной фирмы.

5.3.11 Моногидрат цистеиновой кислоты, например, производства фирмы «Sigma»*.
_______________
* Информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не содержит обязательств применять оборудование и материалы только данной фирмы.

5.3.12 Фенилизотиоцианат, например, производства фирмы «Acros Organics»*, кат. номер 16097.
_______________
* Информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не содержит обязательств применять оборудование и материалы только данной фирмы.

5.3.13 -циклодекстрин, например, производства фирмы «Fluka»*, кат. номер 28707.
_______________
* Информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не содержит обязательств применять оборудование и материалы только данной фирмы.

5.3.14 Серная кислота — по ГОСТ 4204, х.ч.

5.3.15 Азотная кислота — по ГОСТ 4461, х.ч.

Примечание — Допускается использование реактивов аналогичной или более высокой квалификации, в том числе импортных по качеству не ниже указанных .

6.1 Условия проведения испытаний

При подготовке и проведении испытаний должны быть соблюдены следующие условия:

— температура окружающей среды

— относительная влажность воздуха, не более

6.2 Отбор и подготовка проб

6.2.1 Отбор проб по ГОСТ Р ИСО 6497, ГОСТ 13586.3, ГОСТ 13979.0, ГОСТ 17681, ГОСТ 27668 или в соответствии с другими нормативными документами на исследуемые продукты.

6.2.2 Подготовка проб к испытанию — по ГОСТ Р 51419.

6.3 Подготовка лабораторной посуды

Лабораторную посуду моют только серной (см. 5.3.4) или азотной кислотой (см. 5.3.15), без применения других моющих средств, тщательно промывают водопроводной и ополаскивают дистиллированной водой. Запрещается использовать для мытья посуды хромовую смесь.

6.4 Приготовление растворов

6.4.1 Приготовление раствора гидроксида натрия для промывания капилляра

В стакан из термостойкого стекла вместимостью 250 см (см. 5.2.12) помещают 2 г гидроксида натрия (см. 5.3.2) и добавляют 100 см дистиллированной воды (см. 5.3.1).

Срок хранения раствора в полиэтиленовой емкости (см. 5.2.9) — не более 6 мес.

6.4.2 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации 1,0 моль/дм

В мерную колбу вместимостью 100 см (см. 5.1.3) пипеткой (см. 5.1.4) вносят 8,3 см соляной кислоты (см. 5.3.3) и доводят до метки дистиллированной водой (см. 5.3.1).

Срок хранения раствора не ограничен.

6.4.3 Приготовление раствора фосфорно-кислого натрия двузамещенного

В мерную колбу вместимостью 100 см (см. 5.1.3) помещают (4,78±0,05) г 12-водного фосфорно-кислого натрия двузамещенного (см. 5.3.6), добавляют 50-60 см дистиллированной воды (см. 5.3.1), перемешивают до полного растворения, затем доводят объем до метки дистиллированной водой.

Срок хранения раствора — не более 2 мес.

6.4.4 Приготовление раствора фосфорно-кислого натрия однозамещенного

В мерную колбу вместимостью 100 см (см. 5.1.3) помещают (2,28±0,05) г моногидрата однозамещенного фосфорно-кислого натрия (см. 5.3.7), добавляют 50-60 см дистиллированной воды (см. 5.3.1), перемешивают до полного растворения, затем доводят объем до метки дистиллированной водой.

Срок хранения раствора — не более 2 мес.

Примечание — Для приготовления раствора можно использовать также дигидрат однозамещенного фосфорно-кислого натрия, в этом случае его масса для приготовления раствора объемом 100 см составит (2,57±0,05) г.

6.4.5 Приготовление запасного фосфатного буферного раствора

В мерную колбу вместимостью 100 см (см. 5.1.3) вносят 50 см раствора фосфорно-кислого натрия двузамещенного (см. 6.4.3) и 5,0 см раствора фосфорно-кислого натрия однозамещенного (см. 6.4.4), перемешивают, доводят до метки дистиллированной водой. Значение рН полученного раствора составляет 7,7-7,8.

6.4.6 Приготовление раствора -циклодекстрина

В мерную колбу вместимостью 50 см (см. 5.1.3) вносят (0,570±0,005) г -циклодекстрина (см. 5.3.15), добавляют 25-30 см дистиллированной воды (см. 5.3.1) и перемешивают. При необходимости колбу нагревают на теплой водяной бане (см. 5.2.13) при температуре не более 50 °С и после полного растворения объем доводят до метки дистиллированной водой.

Срок хранения раствора — не более 2 мес.

6.4.7 Приготовление электролита

В мерную колбу вместимостью 25 см (см. 5.1.3) вносят 10 см раствора -циклодекстрина (см. 6.4.6), добавляют 10 см запасного фосфатного буферного раствора (см. 6.4.5), доводят до метки дистиллированной водой (см. 5.3.1) и перемешивают. Приготовленный раствор электролита содержит 30 ммоль/дм фосфат-ионов и 4 ммоль/дм -циклодекстрина.

Срок хранения раствора — не более 2 недель.

6.4.9 Приготовление раствора углекислого натрия молярной концентрации 0,1 моль/дм

В мерную колбу вместимостью 25 см (см. 5.1.3) вносят (0,715±0,005) г 10-водного углекислого натрия (см. 5.3.5), добавляют 15 см дистиллированной воды (см. 5.3.1), перемешивают до полного растворения, затем доводят объем до метки дистиллированной водой.

Срок хранения раствора в полиэтиленовой емкости — не более 2 мес.

6.4.10 Приготовление раствора фенилизотиоцианата

В мерную колбу вместимостью 25 см (см. 5.1.3) вносят 0,40 см фенилизотиоцианата (далее — ФИТЦ) (см. 5.3.12), доводят до метки изопропиловым спиртом (см. 5.3.4) и тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора в холодильнике (см. 5.2.4) при температуре от 2 °С до 8 °С в емкости из темного стекла с завинчивающейся крышкой — не более 2 мес.

Примечание — Вся работа по приготовлению раствора ведется в перчатках в вытяжном шкафу.

6.4.11 Приготовление окислительной смеси

В стеклянной емкости с крышкой (см. 5.2.8) смешивают одну объемную часть 30%-ного пероксида водорода и девять объемных частей концентрированной муравьиной кислоты, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в вытяжном шкафу и используют в день приготовления.

6.5 Приготовление градуировочных и контрольных растворов

6.5.1 Все растворы, приготовленные в соответствии с пунктом 6.5, хранят в холодильнике (см. 5.2.4) при температуре от 2 °С до 8 °С.

Допускается отклонение массы взвешенных аминокислот от указанных ниже в пределах ±0,001 г. При этом массовую концентрацию аминокислоты в растворе уточняют в соответствии с фактической массой.

6.5.2 Приготовление запасных растворов аланина, аргинина, аспарагиновой кислоты, валина, гистидина, глицина, глутаминовой кислоты, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, пролина, серина, треонина.

В отдельные виалы вместимостью 10 см (см. 5.2.8) помещают аминокислоты (см. 5.3.10), масса которых составляет:

— для аргинина в форме гидрохлорида аргинина (0,0242±0,0001) г;

— для гистидина в форме моногидрата гидрохлорида гистидина (0,0270±0,0001) г;

— для лизина в форме гидрохлорида лизина (0,0249±0,0001) г;

— для остальных аминокислот (0,0200±0,0001) г.

В каждую виалу добавляют пипеткой (см. 5.1.4) или дозатором (см. 5.1.5) 5,0 см дистиллированной воды (см. 5.3.1) и перемешивают до растворения аминокислоты. При необходимости растворы нагревают на водяной бане (см. 5.1.13) при температуре 60 °С — 70 °С.

Массовая концентрация аминокислот в запасных растворах — 4,0 г/дм .

Срок хранения запасных растворов аспарагиновой и глутаминовой кислот — не более 1 мес.

Срок хранения запасных растворов остальных аминокислот — не более 4 мес.

Примечание — Признаком непригодности растворов аспарагиновой и глутаминовой кислот является выпадение аморфного осадка, нерастворимого при нагревании.

6.5.3 Приготовление запасных растворов фенилаланина, тирозина

В отдельные виалы вместимостью 20 см (см. 5.2.8) помещают (0,0100±0,0001) г соответствующей аминокислоты (см. 5.3.12), добавляют 1,0 см раствора соляной кислоты (см. 6.4.2), 9,0 см дистиллированной воды 0* (см. 5.3.1) и перемешивают содержимое до полного растворения. При необходимости растворы нагревают на водяной бане (см. 5.1.13) при температуре 60 °С — 70 °С.
_______________
* Текст документа соответствует оригиналу. — Примечание изготовителя базы данных.

6.5.4 Приготовление запасного раствора цистина (в форме цистеиновой кислоты)

В стаканчик для взвешивания (далее — бюкс) (см. 5.2.10) помещают (0,0400±0,0001) г цистина (см. 5.3.12), приливают 1,0 см окислительной смеси (см. 6.4.11), перемешивают до растворения и выпаривают раствор досуха в токе теплого воздуха. Сухой остаток растворяют в 10 см дистиллированной воды и переносят в стеклянную емкость с плотно завинчивающейся крышкой для хранения.

Массовая концентрация цистина (в форме цистеиновой кислоты) в запасном растворе — 4,0 г/дм .

Для приготовления запасного раствора цистина допускается использовать моногидрат цистеиновой кислоты (см. 5.3.13).

Срок хранения запасного раствора цистина — не более 3 мес.

6.5.5 Приготовление раствора смеси аминокислот по схеме испытаний 1 (см. 7.1)

В стеклянную емкость с герметичной крышкой (см. 5.2.8) вводят дозатором (см. 5.1.5) по 0,05 см запасных растворов аланина, аргинина, валина, гистидина, глицина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, пролина, серина и треонина (см. 6.5.2), по 0,2 см растворов фенилаланина и тирозина (см. 6.5.3), добавляют 1,0 см дистиллированной воды (см. 5.3.1), тщательно перемешивают.

Номинальные значения массовой концентрации каждой аминокислоты в смеси — 100 мг/дм .

Срок хранения приготовленного раствора — не более 2 недель.

6.5.6 Приготовление раствора смеси аминокислот по схеме испытаний 2 (см. 7.1)

В стеклянную емкость с герметичной крышкой (см. 5.2.8) вводят по 0,05 см запасных растворов аспарагиновой и глутаминовой кислот (см. 6.5.2) и раствора цистина в форме цистеиновой кислоты (см. 6.5.4), добавляют дозатором 1,85 см дистиллированной воды (см. 5.3.1) и тщательно перемешивают.

Номинальные значения массовой концентрации каждой аминокислоты в смеси — 100 мг/дм .

Срок хранения приготовленного раствора — не более 2 недель.

источник

Содержимое (Table of Contents)

Капиллярный электрофорез – это физический метод анализа, основанный на миграции внутри капилляра заряженных частиц в растворе электролита под влиянием приложенного электрического поля.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Капиллярный ОФС.1.2.1.0022.15

электрофорез Вводится впервые

Скорость миграции частиц определяется их электрофоретической подвижностью и электроосмотической подвижностью буферного раствора.

Электрофоретическая подвижность вещества (μ_эф) зависит от его характеристик (электрического заряда, размеров и формы) и от характеристик буферной среды, в которой происходит разделение (типа и ионной силы электролита, рН, вязкости и добавок):

где q – эффективный заряд частицы;

η – вязкость раствора электролита;

r – стоксовский радиус частицы.

Электрофоретическую скорость (ν_эф) для вещества сферической формы определяют по формуле:

где E – сила электрического поля;

V – приложенное напряжение;

Когда к капилляру, заполненному буферным раствором, приложено электрическое поле, внутри капилляра образуется поток растворителя, называемый электроосмотическим потоком. Скорость и направление электроосмотического потока зависят от электроосмотической подвижности (μ_эо), определяемой знаком и плотностью заряда на внутренней стенке капилляра, а также характеристиками буфера:

где ε – диэлектрическая константа буфера;

ζ – дзета-потенциал поверхности капилляра.

Электроосмотическую скорость (ν_эо) рассчитывают по формуле:

Электрофоретическая и электроосмотическая подвижность ионов могут быть направлены в одну и ту же или в противоположные стороны в зависимости от заряда частиц; таким образом, скорость движения растворенного вещества будет определяться уравнением:

Если электроосмотическая скорость выше электрофоретической, можно одновременно разделить как положительно, так и отрицательно заряженные ионы. Время, затраченное ионом для миграции от конца, в котором вводится образец, до места детекции (l – эффективная длина капилляра), определяют по формуле:

Как правило, капилляры из плавленого кварца без покрытия при pH выше 3 несут на внутренней поверхности отрицательный заряд из-за диссоциации силанольных групп. При этом электроосмотический поток направлен от анода к катоду.

В некоторых случаях необходимо уменьшить или изменить направление электроосмотического потока. Для этого различным образом модифицируют внутреннюю стенку капилляра или изменяют рН буферного раствора.

После введения образца в капилляр каждый анализируемый ион движется внутри фонового электролита в виде отдельной зоны в соответствии со своей электрофоретической подвижностью. Степень размывания каждой зоны растворенного соединения определяется совокупностью различных причин. В идеальном случае единственной причиной размывания зон является продольная молекулярная диффузия растворенного вещества вдоль капилляра. В этом, идеальном, случае эффективность разделения полосы, характеризуемая числом теоретических тарелок (N), выражается формулой:

где D – молекулярный коэффициент диффузии растворенного вещества в буферном растворе.

На практике на размывание полос значительное влияние оказывают тепловое рассеяние, адсорбция образца на стенке капилляра, различная проводимость между образцом и буфером, длительность ввода пробы, размеры детектирующей ячейки и различия уровней жидкости в емкостях с буферными растворами.

Разделение между двумя полосами, называемое разрешением (R_s), определяют по формуле (8):

где μ_эфб и μ_эфа – электрофоретические подвижности каждого из двух разделенных ионов;

– их средняя электрофоретическая подвижность.

Среднюю электрофоретическую подвижность определяют по формуле:

Система для капиллярного электрофореза состоит из высоковольтного источника напряжения; двух флаконов с буферными растворами и погруженными в них электродами; капилляра, заполненного соответствующим раствором и погруженного обоими концами во флаконы с буферными растворами; системы ввода образца; детектора, способного в режиме реального времени регистрировать вещества, проходящие мимо оптического окна капилляра; системы термостатирования; регистрирующего прибора или подключенного компьютера.

Для введения пробы могут использоваться три способа: гидростатический – за счет разного уровня буферных растворов, гидродинамический – с помощью прилагаемого давления или вакуума и электрокинетический – благодаря прилагаемому напряжению. В последнем случае степень ввода в капилляр каждого компонента пробы зависит от соответствующей электрофоретической подвижности. Электрокинетическая система ввода для многокомпонентной смеси с разной электрофоретической подвижностью ведет к изменению соотношения концентраций ее составляющих и в данном случае может адекватно применяться лишь для качественного анализа. При условии определения в многокомпонентной смеси одного или двух соединений этот метод может использоваться и для количественного анализа. Кроме того, такой способ введения может позволить увеличить чувствительность анализа.

Детектирование осуществляется с помощью абсорбционной спектрофотометрии в ультрафиолетовой и видимой областях, флуориметрии, кондуктометрии, амперометрии или масс-спектрометрии.

Для обнаружения не поглощающих в ультрафиолетовой области и не флуоресцирующих соединений используется непрямое детектирование. В этом случае в ведущий электролит вводится вещество, поглощающее ультрафиолетовое излучение и образующее выраженное фоновое поглощение. При этом зона определяемого вещества визуализируется в виде обратного пика. С использованием специального программного обеспечения электрофореграмме придают стандартный вид.

Применяемый раствор электролита фильтруют для того, чтобы удалить крупные частицы (размером более 0,45 мкм), и дегазируют для предотвращения образования пузырьков воздуха, которые могут быть помехой для детектирующей системы или могут нарушить электропроводность в капилляре во время проведения анализа. Для хорошей воспроизводимости времени миграции анализируемых компонентов проб для каждого определения должна быть разработана определенная процедура промывки капилляра.

Основными формами проведения капиллярного электрофореза являются: капиллярный зонный электрофорез, мицеллярная электрокинетическая хроматография, капиллярный гель-электрофорез, капиллярное изоэлектрическое фокусирование и капиллярный изотахофорез.

Аналиты разделяются в капилляре, содержащем только буферный раствор. Разделение происходит за счет того, что различные компоненты образца движутся с разными скоростями, образуя так называемые зоны. Скорость движения каждой зоны зависит от электрофоретической подвижности растворенного вещества и от электроосмотического потока в капилляре. Для уменьшения адсорбции веществ на поверхности плавленого кварца могут использоваться капилляры с модифицированной внутренней поверхностью.

Использование капиллярного зонного электрофореза позволяет выполнить разделение как малых (молекулярная масса Мицеллярная электрокинетическая хроматография

В мицеллярной электрокинетической хроматографии разделение осуществляется в растворе электролита, содержащего поверхностно-активное вещество в концентрации выше критической концентрации мицеллообразования. Молекулы растворенного вещества распределяются между буферным раствором и псевдостационарной фазой, состоящей из мицелл. Этот метод может использоваться для разделения как заряженных, так и нейтральных молекул. В качестве анионного поверхностно-активного вещества наиболее часто используется додецилсульфат натрия, в качестве катионного – соли цетилтриметиламмония.

При нейтральных и щелочных значениях рН возникает сильный электроосмотический поток, который движет ионы разделяющего буфера в сторону катода. При использовании в качестве поверхностно-активного вещества додецилсульфата натрия электрофоретическое движение анионных мицелл направлено в противоположную сторону – к аноду. В результате суммарная скорость движения мицелл снижена по сравнению с основным потоком раствора электролита. В случае нейтральных веществ скорость движения компонента, не имеющего электрофоретической подвижности, зависит только от его коэффициента распределения между мицеллой и водной средой. На электрофореграмме сначала появляется пик маркера электроосмотического потока, затем пики аналитов, и в конце – пик маркера мицелл. Время между первым и последним пиком называется окном разделения. На движение заряженных веществ влияют как их коэффициенты распределения между мицеллой и водным буферным раствором, так и их собственная электрофоретическая подвижность.

Движение аналитов и разрешение может быть описано термином «фактор удерживания (k)», представляющим собой отношение молярных долей аналита в мицелле и в подвижной фазе. Для нейтрального вещества k вычисляют по формуле:

где t_R – время миграции аналита;

t – время миграции неудерживаемого вещества;

t_mc – время миграции мицеллы;

K – коэффициент распределения аналита;

V_S – объем мицеллярной фазы;

Разрешение для двух близко движущихся аналитов (R_S) рассчитывают по формуле:

где N – число теоретических тарелок для одного из аналитов;

α – селективность разделения;

Время разделения обратно пропорционально приложенному напряжению, однако следует учитывать, что увеличение напряжения может вызвать избыточное выделение тепла, приводящее к возникновению градиентов температуры и вязкости буферного раствора. Этот эффект вызывает уширение полос и уменьшение разрешения.

Как и в капиллярном зонном электрофорезе, при мицеллярной электрокинетической хроматографии длина и внутренний диаметр капилляра влияют на время анализа и эффективность разделения. Увеличение длины капилляра уменьшает электрическое поле, увеличивает время миграции и повышает эффективность разделения. Уменьшение внутреннего диаметра повышает рассеяние тепла и увеличивает разрешение.

Величина рН среды влияет на электроосмотический поток в немодифицированных капиллярах. Уменьшение рН снижает электроосмотический поток и вследствие этого увеличивает разрешение нейтральных веществ в мицеллярной электрокинетической хроматографии за счет увеличения времени анализа.

Для улучшения разделения гидрофобных веществ в мицеллярной электрокинетической хроматографии используют органические модификаторы (метанол, пропанол, ацетонитрил и др.). При этом необходимо учитывать, что добавление органического модификатора влияет на критическую концентрацию мицеллообразования.

Для разделения с помощью мицеллярной электрокинетической хроматографии энантиомеров в мицеллярную систему включают хиральные селекторы: ковалентно связанные с поверхностно-активным веществом (соли N-додеканоил-L-аминокислот, соли желчных кислот и др.) или вводимые в состав электролита (циклодекстрины).

Для улучшения селективности разделения в мицеллярной электрокинетической хроматографии применяют также вещества, способные изменить взаимодействие аналита с мицеллой путем адсорбции на последней. Этими добавками могут быть второе поверхностно-активное вещество (ионное или неионное), ведущее к образованию смешанных мицелл, катионы металлов, которые распределяются в мицелле и образуют координационные комплексы с аналитом, а также ион-парные соединения, которые взаимодействуют с заряженными компонентами пробы и задерживают их, например, тетрабутиламмония бромид.

В капиллярном гель-электрофорезе разделение происходит внутри капилляра, заполненного гелем, действующим в качестве молекулярного сита. При равном отношении заряда к массе более мелкие компоненты движутся в капилляре быстрее, чем более крупные. Капиллярный гель-электрофорез может быть использован для разделения биологических макромолекул по их молекулярной массе. Электроосмотический поток при этом полностью устраняется путем модификации внутренней стенки капилляра.

В капиллярном гель-электрофорезе используются два типа гелей: химически модифицированные и динамически модифицированные. Химически модифицированные гели, как, например, поперечно-сшитый полиакриламид, поливинилпирролидон, готовятся внутри капилляра посредством полимеризации мономеров. Они обычно связаны с кварцевой стенкой капилляра и не могут быть удалены без его разрушения. При использовании таких гелей для анализа белков в редуцирующих условиях буферный раствор содержит обычно додецилсульфат натрия и образцы перед вводом денатурируют нагреванием в смеси додецилсульфата натрия с 2-меркаптоэтанолом или дитиотрейтолом. При анализе в нередуцирующих условиях 2-меркаптоэтанол и дитиотрейтол не используют. Разделение в поперечно сшитых гелях оптимизируют модификацией буферного раствора (как указано в разделе «Капиллярный зонный электрофорез») и контролем пористости геля во время его приготовления. Пористость этих гелей регулируют изменением концентрации акриламида, а также его соотношения со сшивающим реагентом. Уменьшение пористости геля ведет к уменьшению подвижности аналитов. Из-за неподвижности таких гелей допустимо только электрокинетическое введение пробы.

Динамически модифицированные гели являются гидрофильными полимерами, как, например, линейный полиакриламид, производные целлюлозы, декстран и т. п., которые могут быть растворены в водных разделительных буферных растворах с образованием разделяющей среды, действующей как молекулярное сито. После приготовления они могут быть введены в капилляр под давлением. Замена геля перед каждой инжекцией улучшает воспроизводимость разделения. Пористость гелей увеличивается при использовании полимеров с большей молекулярной массой или уменьшении концентрации полимера. Для выбранного буферного раствора уменьшение пористости геля ведет к уменьшению подвижности компонентов раствора. Так как растворение этих полимеров в буферном растворе дает растворы с низкой вязкостью, может быть использован гидродинамический или электрокинетический ввод пробы.

В изоэлектрическом фокусировании заряженные молекулы движутся под воздействием электрического поля в рН-градиенте, созданном амфолитами с широким диапазоном значений рI, растворенными в буфере разделения.

Тремя основными этапами изоэлектрического фокусирования являются введение пробы, фокусирование и мобилизация.

Этап введения пробы осуществляют в один прием, когда образец смешивается с амфолитами и вводится в капилляр под давлением или под вакуумом, или в несколько приемов, когда в капилляр последовательно вводится ведущий буферный раствор, амфолиты, образец, смешанный с амфолитами, снова амфолиты и, наконец, заключающий буферный раствор. Объем образца должен быть достаточно малым, чтобы не изменять рН-градиент.

На этапе фокусирования амфолиты движутся после приложения напряжения к катоду или аноду согласно их суммарному заряду, создавая, таким образом, рН-градиент от более низкого рН (у анода) к более высокому рН (у катода). Движение каждого аналита продолжается до тех пор, пока он не достигнет рН, соответствующего его изоэлектрической точке (pI).

На этапе мобилизации полосы разделенных компонентов приводятся в движение в сторону детектора благодаря электроосмотическому потоку путем приложения давления после стадии фокусирования или с помощью добавления солей к флакону у катода или анода.

Достигнутое разделение, выражаемое как , зависит от градиента , количества амфолитов, имеющих различные значения pI, молекулярного коэффициента диффузии (D), интенсивности электрического поля (E) и вариации электрофоретической подвижности аналита в зависимости от :

Основными параметрами, которые следует учитывать при разработке разделения, являются:

– Напряжение. В капиллярном изоэлектрическом фокусировании используется очень высокое электрическое поле – от 300 до 1000 В/см на этапе фокусирования.

– Капилляр. Электроосмотический поток должен быть уменьшен или полностью подавлен. Для уменьшения электроосмотического потока используют капилляры с модифицированной внутренней поверхностью.

– Растворы. Анодный флакон заполняется буферным раствором с рН ниже, чем pI наиболее кислого амфолита, а катодный флакон заполняется раствором с рН выше, чем pI наиболее щелочного амфолита. Обычно для анода используется фосфорная кислота, а для катода – натрия гидроксид.

Добавление в раствор амфолита полимера, такого как метилцеллюлоза, ведет к подавлению конвекции и электроосмотического потока при увеличении вязкости. Широкие диапазоны рН используются для оценки изоэлектрической точки, в то время как более узкие диапазоны применяются для улучшения точности.

Осаждение белков в их изоэлектрической точке во время этапа фокусирования предотвращают в случае необходимости с помощью таких буферных добавок, как глицерин, поверхностно-активные вещества, мочевина или цвиттерионные буферные соли.

Изотахофорез – это метод разделения, который проводится в режиме поддержания постоянства тока (все разделенные зоны движутся с одной скоростью). При этом должно обеспечиваться постоянное отношение между концентрацией и подвижностью ионов в каждой зоне.

В капиллярном изотахофорезе применяются два буферных раствора, между которыми находятся зоны аналита. Например, для анализа анионов буфер должен быть выбран таким образом, чтобы ведущий электролит содержал анион с фактической подвижностью, превышающей характерную для разделяемых веществ. Аналогично ион завершающего электролита должен иметь меньшую подвижность, чем подвижность разделяемых веществ. В результате разделения ведущий анион движется первым, за ним движется анион с очередной высокой подвижностью и т. д. В капиллярном изотахофорезе индивидуальные анионы мигрируют в дискретных зонах, но все движутся с той же скоростью, что и ведущий анион. Концентрации анализируемых веществ одинаковы в каждой зоне; таким образом, длина каждой зоны пропорциональна количеству отдельного компонента. Зоны менее сконцентрированные, чем ведущий электролит, сужаются, зоны более сконцентрированные – расширяются. Принцип изотахофореза используется для предварительного концентрирования образца перед разделением его компонентов с помощью других методик капиллярного электрофореза.

Качественный анализ. К качественным результатам относится определение идентичности компонента пробы внутреннему или внешнему стандартному веществу по времени появления соответствующего пика.

Полуколичественный анализ. Полуколичественным результатом считается определение концентрации компонента пробы по площади или высоте пика при соотношении сигнал/фон от 2:1 до 3:1.

Отношение сигнал/шум (S/N) рассчитывают по формуле:

где: H – высота пика целевого компонента на электрофореграмме раствора сравнения, измеренная от максимума пика до базовой линии сигнала;

h – уровень шума на электрофореграмме, полученной после ввода холостой пробы.

Количественный анализ. Количественным результатом является определение концентрации искомого компонента пробы по площади пика при соотношении сигнал/шум больше, чем 3:1.

При количественном анализе образца для компенсации различий во временах миграции от анализа к анализу и для устранения различий в сигналах компонентов образца, обладающих различными временами миграции, площади пиков должны быть нормированы на соответствующие времена миграции. При использовании внутреннего стандарта необходимо убедиться, что ни один пик исследуемого вещества не маскируется пиком внутреннего стандарта.

Абсолютное содержание компонентов рассчитывают по отношению площадей анализируемого пика и пика стандарта. Процентное содержание одного или более компонентов анализируемого образца рассчитывают путем определения процентной доли скорректированных площадей пиков от общей площади всех пиков, за исключением пиков, вызванных растворителями или другими добавленными реактивами (процедура нормализации).

В качестве параметров пригодности системы используются: кажущееся число теоретических тарелок (N), разрешение (R_s), фактор емкости (k’) (только для мицеллярной электрокинетической хроматографии) и фактор симметричности (A_s).

Кажущееся число теоретических тарелок (N) может быть рассчитано эмпирически по формуле:

где t_r – время миграции или расстояние вдоль базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика соответствующего компонента;

w_0,5 – ширина пика на половине высоты.

Разрешение (R_s) между пиками схожей величины двух компонентов вычисляют по формуле:

где t_r_,_b и t_r_,_a – времена миграции или расстояния вдоль базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляров, опущенных из максимумов двух соседних пиков;

Фактор симметричности пика рассчитывают по формуле:

где w_0,05 – ширина пика на 1/20 от его высоты;

d – расстояние между перпендикуляром, опущенным из максимума пика, и передним краем пика на 1/20 от высоты пика.

В качестве параметров пригодности используются также испытания на воспроизводимость площади (стандартное отклонение площади или отношения площади к времени миграции) и воспроизводимость времени миграции (стандартное отклонение времени миграции).

В фармакопейной статье указывают использование определенного капилляра, буферного раствора, метода предварительной подготовки капилляра, пробоподготовки и условий миграции.

источник

ГОСТ Р 55569-2013 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Определение протеиногенных аминокислот методом капиллярного электрофореза

Текст ГОСТ Р 55569-2013 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Определение протеиногенных аминокислот методом капиллярного электрофореза

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ

КОРМА, КОМБИКОРМА, КОМБИКОРМОВОЕ

Определение протеиногенных аминокислот методом капиллярного электрофореза

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 06 сентября 2013 г. № 641-ст

Правила применения настоящего стандарта установлены в ГОСТ Р 1.0—2012 (раздел 8). Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе «Национальные стандарты», а официальный текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случав пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске информационного указателя «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (gost.ru)

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства ло техническому регулированию и метрологии

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КОРМА. КОМБИКОРМА. КОМБИКОРМОВОЕ СЫРЬЕ

Определение протеиногенных аминокислот методом капиллярного электрофореза

Feeds tuffs, compound feeds, feed raw materials. Determination of proteinogenic amino acids using capillary

Настоящий стандарт распространяется на корма, комбикорма и комбикормовое сырье и устанавливает метод определения массовой доли протеиногенных аминокислот в форме фенилизотиокарбамиль-ных производных (далее — ФТК-производных) с помощью капиллярного электрофореза.

Методика измерений позволяет определять общее содержание (свободные и связанные формы в сумме) отдельных аминокислот в пробах. Поскольку в процессе разложения проб аспарагин и глутамин количественно гидролизуются до аспарагиновой и глутаминовой кислот соответственно, то данные по содержанию аспарагиновой и глутаминовой кислот представляют собой суммарное содержание этих кислот и соответствующих амидов. В условиях проведения измерений лейцин и изо-лейцин не разделяются, поэтому предусмотрено их суммарное определение.

Стандарт позволяет определять содержание аминокислот в следующих диапазонах измерений:

— аланин (Ala) от 0.25 до 10.0 включ., %

— аргинин (Arg) от 0.5 до 10.0 включ., %

• аспарагиновая кислота и аспарагин в сумме (Asp. Asn) от 0.5 до 10.0 включ.. %

• валин (Val) от 0.5 до 10.0 включ., %

• гистидин (His) от 0.5 до 10,0 включ., %

• глицин (Gly) от 0.25 до 10.0 включ., %

• глутаминовая кислота и глутамин в сумме (Glu, Gin) от 0.5 до 10,0 включ.. %

• лейцин и изолейцин в сумме (Leu. Не) от 0.25 до 10.0 включ., %

до 20.0 включ., % до Ю.О включ., % до Ю.О включ., % до Ю.О включ., % до Ю.О включ.. % до Ю.О включ., % до 10.0 включ., % до Ю.О включ., %.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-86 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 84-76 Реактивы. Натрий углекислый 10-водный. Технические условия ГОСТ 177-88 Водорода перекись. Технические условия

ГОСТ 245-76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый одиозамещенный 2-водный. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83. ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилин* дры. мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 4172-76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный. Технические условия

ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия ГОСТ 4461-77 Реактивы. Кислота азотная. Технические условия ГОСТ 5848-73 Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия ГОСТ 9805-84 Спирт изопропиловый. Технические условия ГОСТ 13S8S.3-83 Зерно. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 13979.0-86 Жмыхи, шроты и горчичный порошок. Правила приемки и методы отбора проб ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия ГОСТ 17681-82 Мука животного происхождения. Методы испытаний

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 27668-88 Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб

ГОСТ 28311-89 Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ Р 12.1.019-2009 Система стандартов безопасности труда. Электробезоласность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результа

тов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике ГОСТ Р ИСО 6497-2011 Корма для животных. Отбор проб

ГОСТ Р 51419-99 (ИСО 6498-98) Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Подготовка испытуемых проб

ГОСТ Р 53228-2008 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с учетом всех внесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт. на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт. на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то эго положение рекомендуется применять без учета данного изменения. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссыпку.

Сущность метода заключается е разложении пробы для анализа кислотным гидролизом с переводом аминокислот в свободные формы, получении ФТК-производных аминокислот, дальнейшем их разделении и количественном определении методом капиллярного электрофореза.

Метод предусматривает две схемы испытаний (см. 7.1). которые различаются процедурой под* готовки пробы, условиями электрофоретического определения и перечнем опредепяемых амикокис* лот.

4.1 При выполнении испытаний необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007. требования эпектробвзопасности при работе с электроприборами по ГОСТ Р 12.1.019 и ГОСТ 12.2.007.0, а также требования, изложенные в технической документации на используемые приборы.

4.2 Работа с химическими реактивами должна проводиться в вытяжном шкафу.

4.3 Помещение должно быть оснащено вентиляционными системами по ГОСТ 12.4.021. средствами пожаротушения по ГОСТ 12.4.009 и соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004.

4.4 Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать допустимых значений по ГОСТ 12.1.005.

5.1.1 Система (анализатор) капиллярного электрофореза (далее — прибор) с источником высокого напряжения положительной полярности, оснащенная кварцевым капилляром длиной 75 см и внутренним диаметром 50 мкм. фотометрическим или спектрофотометрическим детектором, позволяющим проводить измерения при длине волны от 250 до 260 нм. и компьютером со специальным программным обеспечением для регистрации и обработки электрофореграмм. например, система капиллярного электрофореза «Капель» с программным обеспечением «Эльфоран». в Государственном реестре средств измерений зарегистрирована за No 17727-06*.

5.1.2 Весы, обеспечивающие точность взвешивания с пределом допускаемой абсолютной погрешности не более ± 0.1 мг по ГОСТ Р 53228.

5.1.4 Пипетки градуированные 1(2,3, 5>-1(1а, 2. 2а)-2-5(10) по ГОСТ 29227.

5.1.5 Дозаторы пипеточные одноканальные переменного объема 10-100 мм 3 . 100-1000 мм 3 . 1000-5000 мм 3 по ГОСТ 28311.

5.1.6 Цилиндры мерные 1(2)-25(250)по ГОСТ 1770.

5.1.7 pH-метр лабораторный (абсолютная погрешность измерения не более ± 0.05 единиц pH).

1 Средства измерений должны быть поверены а установленные сроки.

5.2 Вспомогательные устройства и материалы

5.2.1 Дистиллятор или аппарат для перегонки воды (кварцевый или стеклянный).

5.2.2 Центрифуга лабораторная с частотой вращения не менее 5000 об/мин.

5.2.3 Шкаф сушильный с рабочей температурой не ниже 150 *С и точностью поддержания температуры не более ± 2 *С.

5.2.4 Холодильник бытовой — по ГОСТ 16317.

5.2.5 вентилятор бытовой, обеспечивающий поток теплого воздуха.

5.2.6 Пробирки однократного применения (типа Эппендорф) вместимостью 1.5 см 3 .

‘ Информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не содержит обязательств применять оборудование данной марки.

5.2.7 Виалы с завинчивающимися термостойкими крышками и фторопластовыми вкладышами вместимостью 1S-25 см > (далее — виалы для гидролиза).

5.2.8 Виалы с завинчивающими крышками вместимостью 10-40 см 3 .

5.2.9 Полиэтиленовые емкости вместимостью 50.100 см 3 .

5.2.10 Стаканчики для взвешивания СВ-14/8(19/9) — по ГОСТ 25336.

5.2.11 Кварцевые чаши 20 (40. 50) по ГОСТ 19908 или выпарительные чашки 1 (2) по ГОСТ 9147.

5.2.12 Стаканы 8-1(2)-250 (500)-ТХС по ГОСТ 25336.

5.2.13 Баня водяная с регулятором нагрева.

5.2.14 Электроплитка бытовая — по ГОСТ 14919.

5.2.15 Шприц медицинский одноразовый вместимостью 10 (20) см 3 по ГОСТ Р ИСО 7886-1.

5.2.16 Фильтры обеззоленные «синяя лента».

5.2.17 Оправа для фильтра, например, производства фирмы «Sartorius Stedim» с целлюлозноацетатными фильтрами (размер пор 0.2 мкм. диаметр 25 мм) или шприцевые одноразовые фильтры (размер пор 0.2 мкм. диаметр 25 мм. ацетат целлюлозы), например. «Minisart» производства фирмы «Sartorius Stedim».

5.3.1 Вода дистиллированная — по ГОСТ 6709.

5.3.2 Гидроокись натрия — по ГОСТ 4328. к. ч.

5.3.3 Соляная кислота — по ГОСТ 3118. х. ч.

5.3.4 Спирт изопропиловый (2-пропанол) — по ГОСТ 9805. абсолютизированный.

5.3.5 Натрий углекислый 10-водный — по ГОСТ 84, х. ч.

5.3.6 Натрий фосфорно-кислый двузамещенный 12-водный — по ГОСТ 4172. х. ч.

5.3.7 Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный — по ГОСТ 245 или моногидрат, ч.

5.3.8 Муравьиная кислота — по ГОСТ 5848. ч. д. а.

5.3.9 Пероксид водорода — по ГОСТ 177, 30 %, медицинский.

5.3.10 Набор L-аминокислот, например, набор LAA-21 производства фирмы «Sigma» .

5.3.11 Моногидрат цистеиновой кислоты, например, производства фирмы «Sigma»’.

5.3.12 Фенилизотиоцианат, например, производства фирмы «Acros Organics»*, кат. номер 16097.

5.3.13 р-циклодекстрин. например, производства фирмы «Пика»’, кат. номер 28707.

5.3.14 Серная кислота — по ГОСТ 4204. х. ч.

5.3.15 Азотная кислота — по ГОСТ 4461, х. ч.

Примечание — Допускается использование реактивов аналогичной или более высокой квалификации. в том числе импортных ло качеству не ниже указанных.

6.1 Условия проведения испытаний

При подготовке и проведении испытаний должны быть соблюдены следующие условия:

— температура окружающей среды. от 15 °С до 25 °С;

• относительная влажность воздуха, не более. 80 %:

— атмосферное давление . (97 ± 10) кЛа.

6.2 Отбор и подготовка проб

6.2.1 Отбор проб по ГОСТ Р ИСО 6497. ГОСТ 13586.3. ГОСТ 13979.0, ГОСТ 17681. ГОСТ 27668 или в соответствии с другими нормативными документами на исследуемые продукты.

6.2.2 Подготовка проб к испытанию — по ГОСТ Р 51419.

6.3 Подготовка лабораторной посуды

Лабораторную посуду моют только серной (см. 5.3.4) или азотной кислотой (см. 5.3.15). без применения других моющих средств, тщательно промывают водопроводной и ополаскивают дистиллированной водой. Запрещается использовать для мытья посуды хромовую смесь.

Информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не содержит обязательств применять оборудование и материалы только данной фирмы.

6.4 Приготовление растворов

6.4.1 Приготовление раствора гидроксида натрия для промывания капилляра

В стакан из термостойкого стекла вместимостью 250 см 3 (см. 5.2.12) помещают 2 г гидроксида натрия (см. 5.3.2) и добавляют 100 см 3 дистиллированной воды (см. 5.3.1).

Срок хранения раствора в полиэтиленовой емкости (см. 5.2.9) — не более 6 мес.

6.4.2 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации с (HCI) *1.0 моль/дм 3

В мерную колбу вместимостью 1С0 см 3 (см. 5.1.3) пипеткой (см. 5.1.4) вносят 8.3 см 3 соляной кислоты (см. 5.3.3) и доводят до метки дистиллированной водой (см. 5.3.1).

Срок хранения раствора не ограничен.

6.4.3 Приготовление раствора фосфор но-кислого натрия двузамещенного

В мерную колбу вместимостью 100 см* (см. 5.1.3) помещают (4,78 ± 0.05) г 12-водного фосфорно-кислого натрия двузамещенного (см. 5.3.8), добавляют 50-60 см 3 дистиллированной воды (см.

5.3.1) . перемешивают до полного растворения, затем доводят объем до метки дистиллированной водой.

Срок хранения раствора — не более 2 мес.

6.4.4 Приготовление раствора фосфорно-кислого натрия однозамещенного

В мерную колбу вместимостью 100 см 3 (см. 5.1.3) помещают (2.28 ± 0,05) г моногидрата одно-замещенного фосфорно-кислого натрия (см. 5.3.9), добавляют 50-60 см 3 дистиллированной воды (см.

5.3.1) . перемешивают до полного растворения, затем доводят объем до метки дистиллированной водой.

Срок хранения раствора — не более 2 мес.

6.4.5 Приготовление запасного фосфатного буферного раствора

В мерную колбу вместимостью 100 см 3 (см. 5.1.3) вносят 50 см 3 раствора фосфорно-кислого натрия двузамещенного (см. 6.4.3) и 5.0 см 3 раствора фосфорно-кислого натрия однозамещенного (см. 6.4.4). перемешивают, доводят до метки дистиллированной водой. Значение pH полученного раствора составляет 7.7-7.8.

6.4.6 Приготовление раствора р-циклодекстрина

В мерную колбу вместимостью 50 см 3 (см. 5.1.3) вносят (0,570 ± 0.005) г 6-циклодекстрина (см. 5.3.15), добавляют 25-30 см 3 дистиллированной воды (см. 5.3.1) и перемешивают. При необходимости колбу нагревают на теплой водяной бане (см. 5.2.13) при температуре не более 50 *С и после полного растворения объем доводят до метки дистиллированной водой.

Срок хранения раствора — не более 2 мес.

6.4.7 Приготовление электролита

В мерную колбу вместимостью 25 см 3 (см. 5.3.1) вносят 10 см 3 раствора 6-циклодвкстрина (см. 6.4.6), добавляют 10 см 3 запасного фосфатного буферного раствора (см. 6.4.5), доводят до метки дистиллированной водой (см. 5.3.1) и перемешивают. Приготовленный раствор электролита содержит 30 ммоль/дм 3 фосфат-ионов и 4 ммоль/дм 3 6-циклодекстрина.

Срок хранения раствора — не более 2 недель.

6.4.8 Приготовление раствора соляной кислоты, разбавленной в соотношении 1:1 по объему

В химическом термостойком стакане вместимостью 500 см 3 (см. 5.2.12) смешивают 250 см 3 концентрированной соляной кислоты с равным объемом дистиллированной воды (см. 5.3.1).

Срок хранения раствора не ограничен.

6.4.9 Приготовление раствора углекислого натрия молярной концентрации с (Na₂C0₃) * 0.1 моль/дм 3

В мерную колбу вместимостью 25 см 3 (см. 5.1.3) вносят (0,715 ± 0.005) г 10-водного углекислого натрия (см. 5.3.7), добавляют 15 см 3 дистиллированной воды (см. 5.3.1). перемешивают до полного растворения, затем доводят объем до метки дистиллированной водой.

Срок хранения раствора в полиэтиленовой емкости — не более 2 мес.

6.4.10 Приготовление раствора фенилизотиоцианата

В мерную колбу вместимостью 25 см 3 (см. 5.1.3) вносят 0.40 см 3 фенилизотиоцианата (далее -ФИТЦ) (см. 5.3.14), доводят до метки изопропиловым спиртом (см. 5.3.6) и тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора в холодильнике (см. 5.2.4) при температуре от 2 в С до 8 *С в емкости из темного стекла с завинчивающейся крышкой — не более 2 мес.

Примечание — Вся работа по приготовлению раствора ведется в перчатках в вытяжном шкафу.

6.4.11 Приготовление окислительной смеси

В стеклянной емкости с крышкой (см. 5.2.8) смешивают одну объемную часть 30 %-ного пероксида водорода и девять объемных частей концентрированной муравьиной кислоты, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в вытяжном шкафу и используют в день приготовления.

6.5 Приготовление градуировочных и контрольных растворов

6.5.1 Все растворы, приготовленные в соответствии с пунктом 6.5. хранят в холодильнике (см. 5.2.4) при температуре от 2 *С до 8 в С.

Допускается отклонение массы взвешенных аминокислот от указанных ниже в пределах ± 0.001 г. При этом массовую концентрацию аминокислоты в растворе уточняют в соответствии с фактической массой.

В отдельные виалы вместимостью 10 см 3 (см. 5.2.8) помещают аминокислоты (см. 5.3.12). масса которых составляет:

• для аргинина в форме гидрохлорида аргинина (0,0242 ± 0.0001) г;

• для гистидина в форме моногидрата гидрохлорида гистидина (0.0270 ± 0.0001) г.

• для лизина в форме гидрохлорида лизина (0.0249 ± 0.0001) г.

• для остальных аминокислот (0,0200 ± 0,0001) г.

В каждую виалу добавляют пипеткой (см. 5.1.4) или дозатором (см. 5.1.5) 5.0 см 3 дистиллированной воды (см. 5.3.1) и перемешивают до растворения аминокислоты. При необходимости растворы нагревают на водяной бане (см. 5.1.13) при температуре 60 *С — 70 *С.

Массовая концентрация аминокислот в запасных растворах — 4.0 г/дм 3 .

Срок хранения запасных растворов аспарагиновой и глутаминовой кислот — не более 1 мес.

Срок хранения запасных растворов остальных аминокислот — не более 4 мес.

6.5.3 Приготовление запасных растворов фенилаланина, тирозина

В отдельные виалы вместимостью 20 см 3 (см. 5.2.8) помещают (0.0100 ± 0.0001) г соответствующей аминокислоты (см. 5.3.12). добавляют 1,0 см 3 раствора соляной кислоты (см. 6.4.2). 9.0 см 3 дистиллированной воды 0 (см. 5.3.1) и перемешивают содержимое до полного растворения. При необходимости растворы нагревают на водяной бане (см. 5.1.13) при температуре 60 в С — 70 *С.

Массовая концентрация аминокислот е запасных растворах — 1.0 г/дм 3 .

Срок хранения запасных растворов аминокислот — не более 2 мес.

6.5.4 Приготовление запасного раствора цистина (в форме цистеиновой кислоты)

В стаканчик для взвешивания (далее — бюкс) (см. 5.2.10) помещают (0.0400 ± 0,0001) г цистина (см. 5.3.12), приливают 1,0 см 3 окислительной смеси (см. 6.4.11). перемешивают до растворения и выпаривают раствор досуха в токе теплого воздуха. Сухой остаток растворяют в 10 см 3 дистиллированной воды и переносят в стеклянную емкость с плотно завинчивающейся крышкой для хранения.

Массовая концентрация цистина (в форме цистеиновой кислоты) в запасном растворе —

Срок хранения запасного раствора цистина — не более 3 мес.

6.5.5 Приготовление раствора смеси аминокислот по схеме испытаний 1 (см.7.1)

В стеклянную емкость с герметичной крышкой (см. 5.2.6) вводят дозатором (см. 5.1.5) по 0.05 см 3 запасных растворов аланина, аргинина, валина, гистидина, глицина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, пролина. серина и треонина (см. 6.5.2). по 0.2 см 3 растворов фенилаланина и тирозина (см. 6.5.3), добавляют 1.0 см 3 дистиллированной воды (см. 5.3.1), тщательно перемешивают.

Номинальные значения массовой концентрации каждой аминокислоты в смеси — 100 мг/дм 3 .

Срок хранения приготовленного раствора — не более 2 недель.

6.5.6 Приготовление раствора смеси аминокислот по схеме испытаний 2 (см. 7.1)

В стеклянную емкость с герметичной крышкой (см. 5.2.6) вводят ло 0.05 см 3 запасных растворов аспарагиновой и глутаминовой кислот (см. 6.5.2) и раствора цистина в форме цистеиновой кислоты (см. 6.5.4), добавляют дозатором 1.85 см* дистиллированной воды (см. 5.3.1) и тщательно перемешивают.

Номинальные значения массовой концентрации каждой аминокислоты в смеси -100 мг/дм э .

Срок хранения приготовленного раствора — не более 2 недель.

6.5.7 Приготовление контрольного и градуировочных растворов смеси аминокислот по схеме испытаний 1 (см. 7.1)

В четыре стеклянных бюкса (см. 5.2.10) помещают раствор смеси аминокислот (см. 6.5.5) в объемах, указанных в таблице 1. Проводят реакцию получения ФТК-производных аминокислот согласно 6.5.9. Полученные сухие остатки растворяют в 0,5 см 3 дистиллированной воды (см. 5.3.1) и переносят в пробирку типа Элпендорф (см. 5.2.6).

Номинальные значения массовой концентрации каждой аминокислоты в соответствующем градуировочном и контрольном растворе представлены в таблице 1.

Растворы готовят в день проведения испытаний.

Таблица 1- Рабочие градуировочные и контрольный растворы

Массовая концентрация каждой аминокислоты в оаствоое. мг/пм 3

источник