Что такое клинические исследования и зачем они нужны? Это исследования, в которых принимают участие люди (добровольцы) и в ходе которых учёные выясняют, является ли новый препарат, способ лечения или медицинский прибор более эффективным и безопасным для здоровья человека, чем уже существующие.
Главная цель клинического исследования — найти лучший способ профилактики, диагностики и лечения того или иного заболевания. Проводить клинические исследования необходимо, чтобы развивать медицину, повышать качество жизни людей и чтобы новое лечение стало доступным для каждого человека.
У каждого исследования бывает четыре этапа (фазы):
I фаза — исследователи впервые тестируют препарат или метод лечения с участием небольшой группы людей (20—80 человек). Цель этого этапа — узнать, насколько препарат или способ лечения безопасен, и выявить побочные эффекты. На этом этапе могут участвуют как здоровые люди, так и люди с подходящим заболеванием. Чтобы приступить к I фазе клинического исследования, учёные несколько лет проводили сотни других тестов, в том числе на безопасность, с участием лабораторных животных, чей обмен веществ максимально приближен к человеческому;
II фаза — исследователи назначают препарат или метод лечения большей группе людей (100—300 человек), чтобы определить его эффективность и продолжать изучать безопасность. На этом этапе участвуют люди с подходящим заболеванием;
III фаза — исследователи предоставляют препарат или метод лечения значительным группам людей (1000—3000 человек), чтобы подтвердить его эффективность, сравнить с золотым стандартом (или плацебо) и собрать дополнительную информацию, которая позволит его безопасно использовать. Иногда на этом этапе выявляют другие, редко возникающие побочные эффекты. Здесь также участвуют люди с подходящим заболеванием. Если III фаза проходит успешно, препарат регистрируют в Минздраве и врачи получают возможность назначать его;
IV фаза — исследователи продолжают отслеживать информацию о безопасности, эффективности, побочных эффектах и оптимальном использовании препарата после того, как его зарегистрировали и он стал доступен всем пациентам.
Считается, что наиболее точные результаты дает метод исследования, когда ни врач, ни участник не знают, какой препарат — новый или существующий — принимает пациент. Такое исследование называют «двойным слепым». Так делают, чтобы врачи интуитивно не влияли на распределение пациентов. Если о препарате не знает только участник, исследование называется «простым слепым».
Чтобы провести клиническое исследование (особенно это касается «слепого» исследования), врачи могут использовать такой приём, как рандомизация — случайное распределение участников исследования по группам (новый препарат и существующий или плацебо). Такой метод необходим, что минимизировать субъективность при распределении пациентов. Поэтому обычно эту процедуру проводят с помощью специальной компьютерной программы.
- бесплатный доступ к новым методам лечения прежде, чем они начнут широко применяться;
- качественный уход, который, как правило, значительно превосходит тот, что доступен в рутинной практике;
- участие в развитии медицины и поиске новых эффективных методов лечения, что может оказаться полезным не только для вас, но и для других пациентов, среди которых могут оказаться члены семьи;
- иногда врачи продолжают наблюдать и оказывать помощь и после окончания исследования.
- новый препарат или метод лечения не всегда лучше, чем уже существующий;
- даже если новый препарат или метод лечения эффективен для других участников, он может не подойти лично вам;
- новый препарат или метод лечения может иметь неожиданные побочные эффекты.
Главные отличия клинических исследований от некоторых других научных методов: добровольность и безопасность. Люди самостоятельно (в отличие от кроликов) решают вопрос об участии. Каждый потенциальный участник узнаёт о процессе клинического исследования во всех подробностях из информационного листка — документа, который описывает задачи, методологию, процедуры и другие детали исследования. Более того, в любой момент можно отказаться от участия в исследовании, вне зависимости от причин.
Обычно участники клинических исследований защищены лучше, чем обычные пациенты. Побочные эффекты могут проявиться и во время исследования, и во время стандартного лечения. Но в первом случае человек получает дополнительную страховку и, как правило, более качественные процедуры, чем в обычной практике.
Клинические исследования — это далеко не первые тестирования нового препарата или метода лечения. Перед ними идёт этап серьёзных доклинических, лабораторных испытаний. Средства, которые успешно его прошли, то есть показали высокую эффективность и безопасность, идут дальше — на проверку к людям. Но и это не всё.
Сначала компания должна пройти этическую экспертизу и получить разрешение Минздрава РФ на проведение клинических исследований. Комитет по этике — куда входят независимые эксперты — проверяет, соответствует ли протокол исследования этическим нормам, выясняет, достаточно ли защищены участники исследования, оценивает квалификацию врачей, которые будут его проводить. Во время самого исследования состояние здоровья пациентов тщательно контролируют врачи, и если оно ухудшится, человек прекратит своё участие, и ему окажут медицинскую помощь. Несмотря на важность исследований для развития медицины и поиска эффективных средств для лечения заболеваний, для врачей и организаторов состояние и безопасность пациентов — самое важное.
Потому что проверить его эффективность и безопасность по-другому, увы, нельзя. Моделирование и исследования на животных не дают полную информацию: например, препарат может влиять на животное и человека по-разному. Все использующиеся научные методы, доклинические испытания и клинические исследования направлены на то, чтобы выявить самый эффективный и самый безопасный препарат или метод. И почти все лекарства, которыми люди пользуются, особенно в течение последних 20 лет, прошли точно такие же клинические исследования.
Если человек страдает серьёзным, например, онкологическим, заболеванием, он может попасть в группу плацебо только если на момент исследования нет других, уже доказавших свою эффективность препаратов или методов лечения. При этом нет уверенности в том, что новый препарат окажется лучше и безопаснее плацебо.
Согласно Хельсинской декларации, организаторы исследований должны предпринять максимум усилий, чтобы избежать использования плацебо. Несмотря на то что сравнение нового препарата с плацебо считается одним из самых действенных и самых быстрых способов доказать эффективность первого, учёные прибегают к плацебо только в двух случаях, когда: нет другого стандартного препарата или метода лечения с уже доказанной эффективностью; есть научно обоснованные причины применения плацебо. При этом здоровье человека в обеих ситуациях не должно подвергаться риску. И перед стартом клинического исследования каждого участника проинформируют об использовании плацебо.
Обычно оплачивают участие в I фазе исследований — и только здоровым людям. Очевидно, что они не заинтересованы в новом препарате с точки зрения улучшения своего здоровья, поэтому деньги становятся для них неплохой мотивацией. Участие во II и III фазах клинического исследования не оплачивают — так делают, чтобы в этом случае деньги как раз не были мотивацией, чтобы человек смог трезво оценить всю возможную пользу и риски, связанные с участием в клиническом исследовании. Но иногда организаторы клинических исследований покрывают расходы на дорогу.
Если вы решили принять участие в исследовании, обсудите это со своим лечащим врачом. Он может рассказать, как правильно выбрать исследование и на что обратить внимание, или даже подскажет конкретное исследование.
Клинические исследования, одобренные на проведение, можно найти в реестре Минздрава РФ и на международном информационном ресурсе www.clinicaltrials.gov.
Обращайте внимание на международные многоцентровые исследования — это исследования, в ходе которых препарат тестируют не только в России, но и в других странах. Они проводятся в соответствии с международными стандартами и единым для всех протоколом.
После того как вы нашли подходящее клиническое исследование и связались с его организатором, прочитайте информационный листок и не стесняйтесь задавать вопросы. Например, вы можете спросить, какая цель у исследования, кто является спонсором исследования, какие лекарства или приборы будут задействованы, являются ли какие-либо процедуры болезненными, какие есть возможные риски и побочные эффекты, как это испытание повлияет на вашу повседневную жизнь, как долго будет длиться исследование, кто будет следить за вашим состоянием. По ходу общения вы поймёте, сможете ли довериться этим людям.
Если остались вопросы — спрашивайте в комментариях.
источник
Получение белковых фракций с помощью гель-электрофореза входит в перечень манипуляций, выполняемых в лабораториях генетического, биохимического и молекулярного профиля. Зная электрофоретическую подвижность различных белков и пептидов, специалисты выбирают оптимальный способ обработки пробы. Для экстрагирования белков из гомогената тканей чаще всего используют полиакриламидные гели и буферные растворы с додецилсульфатом натрия (SDS) (метод Леммли).
Взвешенный в буфере гомогенат центрифугируют. Для этих целей идеально приспособлены настольные центрифуги с роторами, поддерживающими работу на скорости 10000 об/мин и выше, производства британской компании «Centurion Scientific».
Исследовательская центрифуга Centurion K1015 идеально приспособлена для обработки гомогенатов тканей
В перечень выпускаемых под данной маркой приборов входят как универсальные аппараты, способные работать в широком диапазоне скоростей с роторами различного типа и назначения, так и модели, адаптированные для решения узкого спектра задач – микроцентрифуги с роторами для ПЦР-стрипов, микропробирок и пробирок объемом 15 мл, цитоцентрифуги и т.д.
Лучшими возможностями для подготовки проб с денатурированными белками из гомогенатов биологических тканей обладают центрифуги Centurion исследовательского класса, так как в моделях этой серии можно максимально гибко настраивать параметры и поддерживать стабильную температуру по всему объему центрифужной камеры в строгом соответствии с требованиями методики.
После окончания центрифугирования из пробирок отбирают супернатант, содержащий смесь различных белковых молекул. Их разделение происходит тонких стеклянных сосудах – капиллярах, которые заполняются гелем с требуемым размером пор, выполняющим роль так называемого «молекулярного сита». Мелкие компоненты белковой смеси проходят через такое «сито» быстрее, чем крупные, что позволяет исследователям разделить макромолекулы белка по их молекулярной массе.
Для гель-электрофореза могут использоваться химически и динамически модифицированными гелями. Химически модифицированный полиакриламидный гель получают полимеризацией акриламида прямо внутри капилляра. Такой полиакриламид называется поперечно сшитым. Обычно он прочно связывается с кварцевой внутренней поверхностью капилляра и не может быть удален из сосуда без разрушения последнего. Аналогичными характеристиками обладает поливинилпирролидон (поли-N-винилбутиролактам). Любые химически модифицированные гели неподвижны, поэтому в заполненные ими капилляры пробы вводят только электрокинетическим методом.
Ацетонитрил – модификатор буферного раствора, позволяющий регулировать пористость поперечно-сшитого геля
Оптимизировать процесс разделения белков в поперечно-сшитом геле можно с помощью регулирования его пористости в процессе приготовления и модификации буферного раствора. Буфер модифицируют путем добавления ацетонитрила, метанола и других органических веществ. Это позволяет увеличить растворимость пробы, влияет на степень ионизации молекул в образце и приводит к уменьшению электроосмотических потоков. Если исследователям необходимо разделить оптические изомеры, в буфер добавляют полисахариды, белки или иные хиральные модификаторы. Пористость регулируется посредством изменения количества полимеризируемого вещества и его процентного соотношения со сшивающим агентом.
Динамически модифицированные гели относятся к гидрофильным полимерам. Их получают на основе производных целлюлозы, линейного полиакриламида, декстрана и других веществ, пригодных для растворения в буферах на водной основе. В результате смешивания гидрофильных полимеров с буферами образуется разделяющая среда. Динамически модифицированные гели подвижны, поэтому их можно вводить в капилляры под давлением. Для улучшения воспроизводимости результатов электрофоретического разделения желательно заменять динамически модифицированный гель перед каждым введением пробы.
Схема миграции белковых молекул в капилляре
Для увеличения пористости таких гелей с буферами смешивают полимеры с большой молекулярной массой либо уменьшают концентрацию полимера в водном растворе. Чем меньше пористость динамически модифицированного геля, тем менее подвижны его компоненты. Поскольку вязкость таких растворов низкая, пробы в них можно вводить как электрокинетическим, так и гидродинамическим способом.
Инновационные высокотехнологичные системы для капиллярного электрофореза позволяют быстро и эффективно провести разделение белковых смесей, выделенных из гомогенатов исследуемых тканей. Выпуском таких приборов занимается отечественное предприятие «Люмекс».
Последнее поколение оборудования российского производства представлено моделями КАПЕЛЬ-104Т, КАПЕЛЬ-105/105M и КАПЕЛЬ®-205.
Капель 104Т – система для капиллярного электрофореза с кремниевым фотодиодом
КАПЕЛЬ-104Т – бюджетный вариант для капиллярного электрофореза. Возможностей прибора с избытком хватает для решения любых рутинных задач. Модель оборудована ртутной лампой низкого давления, технические характеристики которой обеспечивают повышенную стабильность светового потока. Кремниевый фотометрический детектор работает в монохроматическом режиме, за счет чего обеспечивается расширение диапазона определяемых концентраций и повышенная чувствительность системы.
Модель КАПЕЛЬ-105 построена на дейтериевой лампе и оснащена спектрофотометрическим детектором, благодаря чему специалист может менять длины волн детектирования, выбирая оптимальные параметры для анализируемых образцов.
В модификации КАПЕЛЬ-105M прибор получает дополнительное программное обеспечение для обработки полученных результатов, а также кассету особой конструкции, позволяющей быстро и просто менять капилляр.
Одно из главных отличий и основных преимуществ система капиллярного электрофореза КАПЕЛЬ®-205 – увеличенная производительность за счет комплектации устройством для автоматического ввода образцов, рассчитанным на загрузку 59 пробирок. Поддержка функции автоматического открытия и закрытия крышек сосудов с пробами исключает испарение и загрязнение последних. Автоматическая промывка капилляров под давлением позволяет использовать модель для работы с фоновыми электролитами высокой вязкости.
«АГ Аналитэксперт» представляет современные настольные центрифуги производства компании «Centurion Scientific» специального и общелабораторного назначения. Широкий модельный ряд включает как специализированные устройства, так и универсальные лабораторные центрифуги, совместимые с большим количеством сменных роторов различного объема. Если у Вас возникла потребность купить надежную центрифугу европейского качества, свяжитесь с нами, мы будем рады Вам помочь!
источник
Содержимое (Table of Contents)
Капиллярный электрофорез – это физический метод анализа, основанный на миграции внутри капилляра заряженных частиц в растворе электролита под влиянием приложенного электрического поля.
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Капиллярный ОФС.1.2.1.0022.15
электрофорез Вводится впервые
Капиллярный электрофорез – это физический метод анализа, основанный на миграции внутри капилляра заряженных частиц в растворе электролита под влиянием приложенного электрического поля.
Скорость миграции частиц определяется их электрофоретической подвижностью и электроосмотической подвижностью буферного раствора.
Электрофоретическая подвижность вещества (μэф) зависит от его характеристик (электрического заряда, размеров и формы) и от характеристик буферной среды, в которой происходит разделение (типа и ионной силы электролита, рН, вязкости и добавок):
где q – эффективный заряд частицы;
η – вязкость раствора электролита;
r – стоксовский радиус частицы.
Электрофоретическую скорость (νэф) для вещества сферической формы определяют по формуле:
где E – сила электрического поля;
V – приложенное напряжение;
Когда к капилляру, заполненному буферным раствором, приложено электрическое поле, внутри капилляра образуется поток растворителя, называемый электроосмотическим потоком. Скорость и направление электроосмотического потока зависят от электроосмотической подвижности (μэо), определяемой знаком и плотностью заряда на внутренней стенке капилляра, а также характеристиками буфера:
где ε – диэлектрическая константа буфера;
ζ – дзета-потенциал поверхности капилляра.
Электроосмотическую скорость (νэо) рассчитывают по формуле:
Электрофоретическая и электроосмотическая подвижность ионов могут быть направлены в одну и ту же или в противоположные стороны в зависимости от заряда частиц; таким образом, скорость движения растворенного вещества будет определяться уравнением:
Если электроосмотическая скорость выше электрофоретической, можно одновременно разделить как положительно, так и отрицательно заряженные ионы. Время, затраченное ионом для миграции от конца, в котором вводится образец, до места детекции (l – эффективная длина капилляра), определяют по формуле:
Как правило, капилляры из плавленого кварца без покрытия при pH выше 3 несут на внутренней поверхности отрицательный заряд из-за диссоциации силанольных групп. При этом электроосмотический поток направлен от анода к катоду.
В некоторых случаях необходимо уменьшить или изменить направление электроосмотического потока. Для этого различным образом модифицируют внутреннюю стенку капилляра или изменяют рН буферного раствора.
После введения образца в капилляр каждый анализируемый ион движется внутри фонового электролита в виде отдельной зоны в соответствии со своей электрофоретической подвижностью. Степень размывания каждой зоны растворенного соединения определяется совокупностью различных причин. В идеальном случае единственной причиной размывания зон является продольная молекулярная диффузия растворенного вещества вдоль капилляра. В этом, идеальном, случае эффективность разделения полосы, характеризуемая числом теоретических тарелок (N), выражается формулой:
где D – молекулярный коэффициент диффузии растворенного вещества в буферном растворе.
На практике на размывание полос значительное влияние оказывают тепловое рассеяние, адсорбция образца на стенке капилляра, различная проводимость между образцом и буфером, длительность ввода пробы, размеры детектирующей ячейки и различия уровней жидкости в емкостях с буферными растворами.
Разделение между двумя полосами, называемое разрешением (Rs), определяют по формуле (8):
где μэфб и μэфа – электрофоретические подвижности каждого из двух разделенных ионов;
– их средняя электрофоретическая подвижность.
Среднюю электрофоретическую подвижность определяют по формуле:
Система для капиллярного электрофореза состоит из высоковольтного источника напряжения; двух флаконов с буферными растворами и погруженными в них электродами; капилляра, заполненного соответствующим раствором и погруженного обоими концами во флаконы с буферными растворами; системы ввода образца; детектора, способного в режиме реального времени регистрировать вещества, проходящие мимо оптического окна капилляра; системы термостатирования; регистрирующего прибора или подключенного компьютера.
Для введения пробы могут использоваться три способа: гидростатический – за счет разного уровня буферных растворов, гидродинамический – с помощью прилагаемого давления или вакуума и электрокинетический – благодаря прилагаемому напряжению. В последнем случае степень ввода в капилляр каждого компонента пробы зависит от соответствующей электрофоретической подвижности. Электрокинетическая система ввода для многокомпонентной смеси с разной электрофоретической подвижностью ведет к изменению соотношения концентраций ее составляющих и в данном случае может адекватно применяться лишь для качественного анализа. При условии определения в многокомпонентной смеси одного или двух соединений этот метод может использоваться и для количественного анализа. Кроме того, такой способ введения может позволить увеличить чувствительность анализа.
Детектирование осуществляется с помощью абсорбционной спектрофотометрии в ультрафиолетовой и видимой областях, флуориметрии, кондуктометрии, амперометрии или масс-спектрометрии.
Для обнаружения не поглощающих в ультрафиолетовой области и не флуоресцирующих соединений используется непрямое детектирование. В этом случае в ведущий электролит вводится вещество, поглощающее ультрафиолетовое излучение и образующее выраженное фоновое поглощение. При этом зона определяемого вещества визуализируется в виде обратного пика. С использованием специального программного обеспечения электрофореграмме придают стандартный вид.
Применяемый раствор электролита фильтруют для того, чтобы удалить крупные частицы (размером более 0,45 мкм), и дегазируют для предотвращения образования пузырьков воздуха, которые могут быть помехой для детектирующей системы или могут нарушить электропроводность в капилляре во время проведения анализа. Для хорошей воспроизводимости времени миграции анализируемых компонентов проб для каждого определения должна быть разработана определенная процедура промывки капилляра.
Основными формами проведения капиллярного электрофореза являются: капиллярный зонный электрофорез, мицеллярная электрокинетическая хроматография, капиллярный гель-электрофорез, капиллярное изоэлектрическое фокусирование и капиллярный изотахофорез.
Аналиты разделяются в капилляре, содержащем только буферный раствор. Разделение происходит за счет того, что различные компоненты образца движутся с разными скоростями, образуя так называемые зоны. Скорость движения каждой зоны зависит от электрофоретической подвижности растворенного вещества и от электроосмотического потока в капилляре. Для уменьшения адсорбции веществ на поверхности плавленого кварца могут использоваться капилляры с модифицированной внутренней поверхностью.
Использование капиллярного зонного электрофореза позволяет выполнить разделение как малых (молекулярная масса Мицеллярная электрокинетическая хроматография
В мицеллярной электрокинетической хроматографии разделение осуществляется в растворе электролита, содержащего поверхностно-активное вещество в концентрации выше критической концентрации мицеллообразования. Молекулы растворенного вещества распределяются между буферным раствором и псевдостационарной фазой, состоящей из мицелл. Этот метод может использоваться для разделения как заряженных, так и нейтральных молекул. В качестве анионного поверхностно-активного вещества наиболее часто используется додецилсульфат натрия, в качестве катионного – соли цетилтриметиламмония.
При нейтральных и щелочных значениях рН возникает сильный электроосмотический поток, который движет ионы разделяющего буфера в сторону катода. При использовании в качестве поверхностно-активного вещества додецилсульфата натрия электрофоретическое движение анионных мицелл направлено в противоположную сторону – к аноду. В результате суммарная скорость движения мицелл снижена по сравнению с основным потоком раствора электролита. В случае нейтральных веществ скорость движения компонента, не имеющего электрофоретической подвижности, зависит только от его коэффициента распределения между мицеллой и водной средой. На электрофореграмме сначала появляется пик маркера электроосмотического потока, затем пики аналитов, и в конце – пик маркера мицелл. Время между первым и последним пиком называется окном разделения. На движение заряженных веществ влияют как их коэффициенты распределения между мицеллой и водным буферным раствором, так и их собственная электрофоретическая подвижность.
Движение аналитов и разрешение может быть описано термином «фактор удерживания (k)», представляющим собой отношение молярных долей аналита в мицелле и в подвижной фазе. Для нейтрального вещества k вычисляют по формуле:
где tR – время миграции аналита;
t – время миграции неудерживаемого вещества;
tmc – время миграции мицеллы;
K – коэффициент распределения аналита;
VS – объем мицеллярной фазы;
Разрешение для двух близко движущихся аналитов (RS) рассчитывают по формуле:
где N – число теоретических тарелок для одного из аналитов;
α – селективность разделения;
Время разделения обратно пропорционально приложенному напряжению, однако следует учитывать, что увеличение напряжения может вызвать избыточное выделение тепла, приводящее к возникновению градиентов температуры и вязкости буферного раствора. Этот эффект вызывает уширение полос и уменьшение разрешения.
Как и в капиллярном зонном электрофорезе, при мицеллярной электрокинетической хроматографии длина и внутренний диаметр капилляра влияют на время анализа и эффективность разделения. Увеличение длины капилляра уменьшает электрическое поле, увеличивает время миграции и повышает эффективность разделения. Уменьшение внутреннего диаметра повышает рассеяние тепла и увеличивает разрешение.
Величина рН среды влияет на электроосмотический поток в немодифицированных капиллярах. Уменьшение рН снижает электроосмотический поток и вследствие этого увеличивает разрешение нейтральных веществ в мицеллярной электрокинетической хроматографии за счет увеличения времени анализа.
Для улучшения разделения гидрофобных веществ в мицеллярной электрокинетической хроматографии используют органические модификаторы (метанол, пропанол, ацетонитрил и др.). При этом необходимо учитывать, что добавление органического модификатора влияет на критическую концентрацию мицеллообразования.
Для разделения с помощью мицеллярной электрокинетической хроматографии энантиомеров в мицеллярную систему включают хиральные селекторы: ковалентно связанные с поверхностно-активным веществом (соли N-додеканоил-L-аминокислот, соли желчных кислот и др.) или вводимые в состав электролита (циклодекстрины).
Для улучшения селективности разделения в мицеллярной электрокинетической хроматографии применяют также вещества, способные изменить взаимодействие аналита с мицеллой путем адсорбции на последней. Этими добавками могут быть второе поверхностно-активное вещество (ионное или неионное), ведущее к образованию смешанных мицелл, катионы металлов, которые распределяются в мицелле и образуют координационные комплексы с аналитом, а также ион-парные соединения, которые взаимодействуют с заряженными компонентами пробы и задерживают их, например, тетрабутиламмония бромид.
В капиллярном гель-электрофорезе разделение происходит внутри капилляра, заполненного гелем, действующим в качестве молекулярного сита. При равном отношении заряда к массе более мелкие компоненты движутся в капилляре быстрее, чем более крупные. Капиллярный гель-электрофорез может быть использован для разделения биологических макромолекул по их молекулярной массе. Электроосмотический поток при этом полностью устраняется путем модификации внутренней стенки капилляра.
В капиллярном гель-электрофорезе используются два типа гелей: химически модифицированные и динамически модифицированные. Химически модифицированные гели, как, например, поперечно-сшитый полиакриламид, поливинилпирролидон, готовятся внутри капилляра посредством полимеризации мономеров. Они обычно связаны с кварцевой стенкой капилляра и не могут быть удалены без его разрушения. При использовании таких гелей для анализа белков в редуцирующих условиях буферный раствор содержит обычно додецилсульфат натрия и образцы перед вводом денатурируют нагреванием в смеси додецилсульфата натрия с 2-меркаптоэтанолом или дитиотрейтолом. При анализе в нередуцирующих условиях 2-меркаптоэтанол и дитиотрейтол не используют. Разделение в поперечно сшитых гелях оптимизируют модификацией буферного раствора (как указано в разделе «Капиллярный зонный электрофорез») и контролем пористости геля во время его приготовления. Пористость этих гелей регулируют изменением концентрации акриламида, а также его соотношения со сшивающим реагентом. Уменьшение пористости геля ведет к уменьшению подвижности аналитов. Из-за неподвижности таких гелей допустимо только электрокинетическое введение пробы.
Динамически модифицированные гели являются гидрофильными полимерами, как, например, линейный полиакриламид, производные целлюлозы, декстран и т. п., которые могут быть растворены в водных разделительных буферных растворах с образованием разделяющей среды, действующей как молекулярное сито. После приготовления они могут быть введены в капилляр под давлением. Замена геля перед каждой инжекцией улучшает воспроизводимость разделения. Пористость гелей увеличивается при использовании полимеров с большей молекулярной массой или уменьшении концентрации полимера. Для выбранного буферного раствора уменьшение пористости геля ведет к уменьшению подвижности компонентов раствора. Так как растворение этих полимеров в буферном растворе дает растворы с низкой вязкостью, может быть использован гидродинамический или электрокинетический ввод пробы.
В изоэлектрическом фокусировании заряженные молекулы движутся под воздействием электрического поля в рН-градиенте, созданном амфолитами с широким диапазоном значений рI, растворенными в буфере разделения.
Тремя основными этапами изоэлектрического фокусирования являются введение пробы, фокусирование и мобилизация.
Этап введения пробы осуществляют в один прием, когда образец смешивается с амфолитами и вводится в капилляр под давлением или под вакуумом, или в несколько приемов, когда в капилляр последовательно вводится ведущий буферный раствор, амфолиты, образец, смешанный с амфолитами, снова амфолиты и, наконец, заключающий буферный раствор. Объем образца должен быть достаточно малым, чтобы не изменять рН-градиент.
На этапе фокусирования амфолиты движутся после приложения напряжения к катоду или аноду согласно их суммарному заряду, создавая, таким образом, рН-градиент от более низкого рН (у анода) к более высокому рН (у катода). Движение каждого аналита продолжается до тех пор, пока он не достигнет рН, соответствующего его изоэлектрической точке (pI).
На этапе мобилизации полосы разделенных компонентов приводятся в движение в сторону детектора благодаря электроосмотическому потоку путем приложения давления после стадии фокусирования или с помощью добавления солей к флакону у катода или анода.
Достигнутое разделение, выражаемое как 
, зависит от градиента 
, количества амфолитов, имеющих различные значения pI, молекулярного коэффициента диффузии (D), интенсивности электрического поля (E) и вариации электрофоретической подвижности аналита в зависимости от 
:
Основными параметрами, которые следует учитывать при разработке разделения, являются:
– Напряжение. В капиллярном изоэлектрическом фокусировании используется очень высокое электрическое поле – от 300 до 1000 В/см на этапе фокусирования.
– Капилляр. Электроосмотический поток должен быть уменьшен или полностью подавлен. Для уменьшения электроосмотического потока используют капилляры с модифицированной внутренней поверхностью.
– Растворы. Анодный флакон заполняется буферным раствором с рН ниже, чем pI наиболее кислого амфолита, а катодный флакон заполняется раствором с рН выше, чем pI наиболее щелочного амфолита. Обычно для анода используется фосфорная кислота, а для катода – натрия гидроксид.
Добавление в раствор амфолита полимера, такого как метилцеллюлоза, ведет к подавлению конвекции и электроосмотического потока при увеличении вязкости. Широкие диапазоны рН используются для оценки изоэлектрической точки, в то время как более узкие диапазоны применяются для улучшения точности.
Осаждение белков в их изоэлектрической точке во время этапа фокусирования предотвращают в случае необходимости с помощью таких буферных добавок, как глицерин, поверхностно-активные вещества, мочевина или цвиттерионные буферные соли.
Изотахофорез – это метод разделения, который проводится в режиме поддержания постоянства тока (все разделенные зоны движутся с одной скоростью). При этом должно обеспечиваться постоянное отношение между концентрацией и подвижностью ионов в каждой зоне.
В капиллярном изотахофорезе применяются два буферных раствора, между которыми находятся зоны аналита. Например, для анализа анионов буфер должен быть выбран таким образом, чтобы ведущий электролит содержал анион с фактической подвижностью, превышающей характерную для разделяемых веществ. Аналогично ион завершающего электролита должен иметь меньшую подвижность, чем подвижность разделяемых веществ. В результате разделения ведущий анион движется первым, за ним движется анион с очередной высокой подвижностью и т. д. В капиллярном изотахофорезе индивидуальные анионы мигрируют в дискретных зонах, но все движутся с той же скоростью, что и ведущий анион. Концентрации анализируемых веществ одинаковы в каждой зоне; таким образом, длина каждой зоны пропорциональна количеству отдельного компонента. Зоны менее сконцентрированные, чем ведущий электролит, сужаются, зоны более сконцентрированные – расширяются. Принцип изотахофореза используется для предварительного концентрирования образца перед разделением его компонентов с помощью других методик капиллярного электрофореза.
Качественный анализ. К качественным результатам относится определение идентичности компонента пробы внутреннему или внешнему стандартному веществу по времени появления соответствующего пика.
Полуколичественный анализ. Полуколичественным результатом считается определение концентрации компонента пробы по площади или высоте пика при соотношении сигнал/фон от 2:1 до 3:1.
Отношение сигнал/шум (S/N) рассчитывают по формуле:
где: H – высота пика целевого компонента на электрофореграмме раствора сравнения, измеренная от максимума пика до базовой линии сигнала;
h – уровень шума на электрофореграмме, полученной после ввода холостой пробы.
Количественный анализ. Количественным результатом является определение концентрации искомого компонента пробы по площади пика при соотношении сигнал/шум больше, чем 3:1.
При количественном анализе образца для компенсации различий во временах миграции от анализа к анализу и для устранения различий в сигналах компонентов образца, обладающих различными временами миграции, площади пиков должны быть нормированы на соответствующие времена миграции. При использовании внутреннего стандарта необходимо убедиться, что ни один пик исследуемого вещества не маскируется пиком внутреннего стандарта.
Абсолютное содержание компонентов рассчитывают по отношению площадей анализируемого пика и пика стандарта. Процентное содержание одного или более компонентов анализируемого образца рассчитывают путем определения процентной доли скорректированных площадей пиков от общей площади всех пиков, за исключением пиков, вызванных растворителями или другими добавленными реактивами (процедура нормализации).
В качестве параметров пригодности системы используются: кажущееся число теоретических тарелок (N), разрешение (Rs), фактор емкости (k’) (только для мицеллярной электрокинетической хроматографии) и фактор симметричности (As).
Кажущееся число теоретических тарелок (N) может быть рассчитано эмпирически по формуле:
где tr – время миграции или расстояние вдоль базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика соответствующего компонента;
w0,5 – ширина пика на половине высоты.
Разрешение (Rs) между пиками схожей величины двух компонентов вычисляют по формуле:
где tr,b и tr,a – времена миграции или расстояния вдоль базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляров, опущенных из максимумов двух соседних пиков;
Фактор симметричности пика рассчитывают по формуле:
где w0,05 – ширина пика на 1/20 от его высоты;
d – расстояние между перпендикуляром, опущенным из максимума пика, и передним краем пика на 1/20 от высоты пика.
В качестве параметров пригодности используются также испытания на воспроизводимость площади (стандартное отклонение площади или отношения площади к времени миграции) и воспроизводимость времени миграции (стандартное отклонение времени миграции).
В фармакопейной статье указывают использование определенного капилляра, буферного раствора, метода предварительной подготовки капилляра, пробоподготовки и условий миграции.
источник
в томском государственном университете
Методы очистки и выделения белков. Часть 2.
Перед тем, как определять первичную структуру белка, белок очищают от многочисленных примесей, среди которых присутствуют: другие белки, неорганические соединения, низкомолекулярные соединения и т.д. Наиболее опасными примесями в белках являются различные протеаз ы — ферменты, расщепляющие полипептидную цепь белка. Очистка белков осложняется также большей подверженности чистых белков денатурации. Все вместе взятое усложняет процесс получения чистого белка в количествах, обеспечивающих возможность определения первичной структуры.
Чистота полученного белка (так называемая гомогенность ) должна быть подтверждена не менее, чем двумя методами, и еще лучш е- иммуноблоттингом , который подтверждает наличие у материала антигенных детерминант, присущих нативному (натуральному, неповрежденному) белку.
Для разделения белков используют такие их физико-химические характеристики, как наличие зарядов, степень гидрофобности, молекулярная масса, наконец, специфические взаимодействия.
Выполняется на капиллярных колонках длиной от 40 см до 1 м. К концам пустотелого кварцевого которого прикладывается разность потенциалов в 10-30 кВ. Под действием электрического поля начинается движение ионов (+) электролита, уравновешивающих отрицательно заряженные группировки ионизированных силанольных групп на внутренней поверхности кварцевого капилляра. Двигающиеся ионы увлекают за собой молекулы растворителя, что вызывает общее течение жидкости в капилляре. Явление носит название электроосмотический поток (ЭОП, EOF). При введении в такую систему анализируемого образца положительно заряженные молекулы анализируемых соединений движутся к катоду быстрее потока жидкости в капилляре, незаряженные молекулы «текут» с потоком, а отрицательно заряженные, удерживаясь положительным зарядом, текут медленней всего, но тем не менее, текут к катоду. Происходит весьма эффективное разделение молекул по зарядам. Этот вариант электрофореза в капилляре наиболее прост и называется зонным электрофорезом (CZE, или КЗЭ). Идентификация осуществляется спектрально (прямая или косвенная УФ-индикация ) или другим подходящим способом (част о- масс-спетрометрически — CE / MS ).
Используются пустотелые кварцевые капилляры внутренними диаметрами 50, 75 и 100 мкм и с эффективной длиной 24,5, 40, 56, 72 и 104 см. С наружной стороны капилляры имеют полиамидное покрытие, улучшающее их прочность. Торцы капиляров обработаны с зеркальной чистотой поверхности. Предусмотрено «окошко» для детектирования по УФ. Кроме того, имеются капилляры с удлиненным оптическим путем детектирования (для капилляров с внутренним диаметром 25 мкм оптический путь составляет 125 мкм, для 50-мкм капилляров- 150 мкм, а для 75 микронных- 200 мкм).
Покрытые изнутри поливиниловым спиртом ( PVA-coated ) капилляры минимизируют гидрофобные и электростатические взаимодействия анализируемых соединений со стенками и, кроме того, снижают электроосмотический поток. Покрытие стабильно в растворах с рН от 2,5 до 9,5. Все это улучшает форму пиков и воспроизводимость времен удерживания.
Капилляры для капиллярной электрохроматографии (СЕС). Имея внутренний диаметр 100 мкм, капилляры заполнены сорбентом для ВЭЖХ ( силикагелевые частицы размером 3 мкм с привитой фазой) под наименованием CEC-Hypersil . В качестве привитой фазы применены углеводородные цепи С8, С18 и Фенил. Капиллярная электрохроматография сочетает разделительную способность ВЭЖХ и эффективность капиллрного электрофореза. На обоих концах капилляров можно создавать избыточное давление для предотвращения выделения пузырьков газа в результате наложения высокого потенциала. Существуют капилляры, заполненные сорбентами с различными диаметрами пор для гель-проникающей хроматографии (разделения молекул по размерам).
Капиллярный электрофорез отличается от родственных ему методов жидкостной хроматографии чрезвычайно высокой эффективностью разделения, теоретическое объяснение которой не найдено до сих пор. Типичный пример разделения белков капиллярным электрофорезом (указано число т.т. по пику каждого соединения):
© khassanov @ MMII — MMX VI II
источник
Впоследствии были предложены технологии разделения на плотных носителях, среди которых особое место заняли гели. Последние сочетали удобства разделения в свободном растворе (в геле 95-99% воды) с возможностью фиксировать результаты электрофореза путем высушивания геля. Среди гелеобразующих веществ вначале получил признание крахмал, затем полисахариды из водорослей агар-агар (агароза) и наконец гели, искусственно получаемые путем полимеризации акриламида.
Полиакриламидный гель стал одним из наиболее популярных носителей для электрофореза. Полимеризацию проводят в буферном растворе. Затем гель помещают в электрофоретическую камеру, заполненную буферным раствором и содержащую электроды для образования электрического поля (рис.1.8). рН и другие параметры буферного раствора выбираются из расчета, чтобы разделяемые молекулы несли отрицательный заряд и двигались в электрическом поле слева направо. Поскольку разделяемые молекулы движутся в геле, те из них, которые имеют большие размеры, будут задерживаться при прохождении через поры геля. Меньшие молекулы будут встречать меньшее сопротивление и, соответственно, двигаться быстрее. В результате, после проведения электрофореза, большие молекулы будут находиться ближе к месту нанесения, чем меньшие.
Рис.1.8. Виды проведения электрофореза в полиакриламидном геле (слева — в трубках с гелем, справа — в прямоугольных блоках)
Следует иметь ввиду, что этот метод позволяет разделять молекулы большей частью по их размеру, и совсем необязательно, — по их молекулярной массе. Для примера рассмотрим две молекулы белка по 1000 аминокислот каждая. Одна из них представляет вытянутую цепь (А), а вторая (за счет образования связей между соседними участками) имеет форму шпильки (Б):
Поскольку они движутся внутри геля, обе молекулы будут вести себя как сферы, диаметр которых равняется длине вытянутой части молекулы. Обе молекулы имеют одинаковую молекулярную массу, однако благодаря тому, что вторичная структура Б де-лает её молекулу короче, чем А, быстрее будет передвигаться Б. Дабы устранить влияние различий по форме и оставить только различия по молекулярной массе, разделяемые молекулы должны иметь развернутую конформацию (без вторичной структуры). Для разрушения вторичной и третичной структуры используются различные методы подготовки препаратов белка.
Подготовка белков. Все белки обладают вторичной и третичной структурной организацией. При этом их молекулы не всегда несут отрицательный заряд в растворе. Для разрушения вторичной и третичной структуры и образования на поверхности белков отрицательного заряда их нагревают и обрабатывают детергентом – додецилсульфатом натрия (ДДС-натрий).
Если соблюсти вышеприведенные условия, разделение молекул при электрофорезе будет осуществляться в зависимости от их молекулярной массы. При этом удается, например, разделить 2 молекулы полинуклеотида, различающиеся на 1 мононуклеотид. Высокомолекулярные молекулы будут двигаться медленнее низкомолекулярных. Длина пройденного молекулой расстояния будет пропорциональна логарифму величины, обратной её молекулярной массе (log 1/MM).
Обычно гели изображают в вертикальном положении, где место нанесения находится вверху, а движение разделяемых молекул направлено сверху вниз. Тогда в верхней части геля располагаются большие молекулы, а в нижней – с меньшей молекулярной массой.
Как правило, рядом с опытными пробами на гель наносится смесь белковых (или каких-то других разделяемых) молекул с известной молекулярной массой. Такие стандарты «молекулярной массы» позволяют прокалибровать пробег молекул. Тогда, зная какое расстояние прошло изучаемое вещество, можно установить его молекулярную массу. Ниже на рисунке 1.9 показан гель после обработки его красителем. Молекулы красителя связываются с каким-то определенным классом макромолекул независимо от последовательности расположения мономеров в их составе.
Рис.1.9. Результат проведения электрофореза в полиакриламидном геле после окраски геля неспецифическим красителем
Изображенный на рис.1.9 образец 1 содержит макромолекулы одного размера. Это может быть очищенный белок. При сравнении с подвижностью стандартов ясно, что молекулярная масса этого соединения около 3. Образец 2. Это может быть смесь белков после окраски геля неспецифическим красителем. Здесь находится так много полос, что среди них невозможно вычленить необходимую. В подобных условиях без зонда (который действует как специфический краситель) нам едва ли удастся получить полезную информацию об интересующем соединении. Учитывая это обстоятельство, для определения индивидуальных белков пользуются сочетанием электрофореза с иммунологическими реакциями (иммуноэлектрофорез) (рис.1.10).
Рис.1.10. Схема проведения иммуноблот анализа для обнаружения белка после проведения электрофореза в полиакриламидном геле (описание этапов приведено в гл.13)
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
Лучшие изречения: На стипендию можно купить что-нибудь, но не больше. 8983 — 
| 7233 — 
или читать все.
195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.
Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно
источник
+7 (499) 346-74-93
+7 (800) 200-74-93 БЕСПЛАТНО ПО РОССИИ
+7 (800) 200-74-93 Бесплатно по России
- Каталог продукции
- Инжиниринг
- Валидация
- Сервис
- Собственное производство
- Наши лаборатории
- Научно-образовательный центр
- Трансфер технологий
DEFAULT_VALUE] => ) [manufacturer] => Array ( [ID] => 7 [TIMESTAMP_X] => 2014-07-29 12:35:13 [IBLOCK_ID] => 1 [NAME] => Производитель [ACTIVE] => Y [SORT] => 500 [CODE] => manufacturer [DEFAULT_VALUE] => [PROPERTY_TYPE] => E [ROW_COUNT] => 1 [COL_COUNT] => 30 [LIST_TYPE] => L [MULTIPLE] => N [XML_ID] => [FILE_TYPE] => [MULTIPLE_CNT] => 5 [TMP_ID] => [LINK_IBLOCK_ID] => 2 [WITH_DESCRIPTION] => N [SEARCHABLE] => N [FILTRABLE] => N [IS_REQUIRED] => Y [VERSION] => 1 [USER_TYPE] => [USER_TYPE_SETTINGS] => [HINT] => [PROPERTY_VALUE_ID] => 2010 [VALUE] => 183 [DESCRIPTION] => [VALUE_ENUM] => [VALUE_XML_ID] => [VALUE_SORT] => [
DEFAULT_VALUE] => ) [paramsInText] => Array ( [ID] => 13 [TIMESTAMP_X] => 2014-08-04 12:50:00 [IBLOCK_ID] => 1 [NAME] => Параметры товара [ACTIVE] => Y [SORT] => 500 [CODE] => paramsInText [DEFAULT_VALUE] => [PROPERTY_TYPE] => S [ROW_COUNT] => 1 [COL_COUNT] => 30 [LIST_TYPE] => L [MULTIPLE] => N [XML_ID] => [FILE_TYPE] => [MULTIPLE_CNT] => 5 [TMP_ID] => [LINK_IBLOCK_ID] => 0 [WITH_DESCRIPTION] => N [SEARCHABLE] => N [FILTRABLE] => N [IS_REQUIRED] => N [VERSION] => 1 [USER_TYPE] => HTML [USER_TYPE_SETTINGS] => Array ( [height] => 200 ) [HINT] => [PROPERTY_VALUE_ID] => [VALUE] => [DESCRIPTION] => [VALUE_ENUM] => [VALUE_XML_ID] => [VALUE_SORT] => [
DEFAULT_VALUE] => ) [bestOffer] => Array ( [ID] => 70 [TIMESTAMP_X] => 2014-08-29 09:59:41 [IBLOCK_ID] => 1 [NAME] => Лучшее предложение [ACTIVE] => Y [SORT] => 500 [CODE] => bestOffer [DEFAULT_VALUE] => [PROPERTY_TYPE] => L [ROW_COUNT] => 1 [COL_COUNT] => 30 [LIST_TYPE] => L [MULTIPLE] => N [XML_ID] => [FILE_TYPE] => [MULTIPLE_CNT] => 5 [TMP_ID] => [LINK_IBLOCK_ID] => 0 [WITH_DESCRIPTION] => N [SEARCHABLE] => N [FILTRABLE] => N [IS_REQUIRED] => N [VERSION] => 1 [USER_TYPE] => [USER_TYPE_SETTINGS] => [HINT] => [PROPERTY_VALUE_ID] => [VALUE] => [DESCRIPTION] => [VALUE_ENUM] => [VALUE_XML_ID] => [VALUE_SORT] => [VALUE_ENUM_ID] => [
DEFAULT_VALUE] => ) [inStock] => Array ( [ID] => 71 [TIMESTAMP_X] => 2014-08-29 09:59:41 [IBLOCK_ID] => 1 [NAME] => Есть на складе [ACTIVE] => Y [SORT] => 500 [CODE] => inStock [DEFAULT_VALUE] => [PROPERTY_TYPE] => L [ROW_COUNT] => 1 [COL_COUNT] => 30 [LIST_TYPE] => L [MULTIPLE] => N [XML_ID] => [FILE_TYPE] => [MULTIPLE_CNT] => 5 [TMP_ID] => [LINK_IBLOCK_ID] => 0 [WITH_DESCRIPTION] => N [SEARCHABLE] => N [FILTRABLE] => N [IS_REQUIRED] => N [VERSION] => 1 [USER_TYPE] => [USER_TYPE_SETTINGS] => [HINT] => [PROPERTY_VALUE_ID] => [VALUE] => [DESCRIPTION] => [VALUE_ENUM] => [VALUE_XML_ID] => [VALUE_SORT] => [VALUE_ENUM_ID] => [
DEFAULT_VALUE] => ) [documents] => Array ( [ID] => 74 [TIMESTAMP_X] => 2015-07-16 10:58:43 [IBLOCK_ID] => 1 [NAME] => Документация [ACTIVE] => Y [SORT] => 500 [CODE] => documents [DEFAULT_VALUE] => [PROPERTY_TYPE] => F [ROW_COUNT] => 1 [COL_COUNT] => 30 [LIST_TYPE] => L [MULTIPLE] => Y [XML_ID] => [FILE_TYPE] => [MULTIPLE_CNT] => 5 [TMP_ID] => [LINK_IBLOCK_ID] => 0 [WITH_DESCRIPTION] => Y [SEARCHABLE] => N [FILTRABLE] => N [IS_REQUIRED] => N [VERSION] => 1 [USER_TYPE] => [USER_TYPE_SETTINGS] => [HINT] => [PROPERTY_VALUE_ID] => [VALUE] => [DESCRIPTION] => [VALUE_ENUM] => [VALUE_XML_ID] => [VALUE_SORT] => [
DEFAULT_VALUE] => ) [pdf] => Array ( [ID] => 81 [TIMESTAMP_X] => 2016-08-26 12:41:46 [IBLOCK_ID] => 1 [NAME] => PDF [ACTIVE] => Y [SORT] => 500 [CODE] => pdf [DEFAULT_VALUE] => [PROPERTY_TYPE] => F [ROW_COUNT] => 1 [COL_COUNT] => 30 [LIST_TYPE] => L [MULTIPLE] => N [XML_ID] => [FILE_TYPE] => [MULTIPLE_CNT] => 5 [TMP_ID] => [LINK_IBLOCK_ID] => 0 [WITH_DESCRIPTION] => Y [SEARCHABLE] => N [FILTRABLE] => N [IS_REQUIRED] => N [VERSION] => 1 [USER_TYPE] => [USER_TYPE_SETTINGS] => [HINT] => [PROPERTY_VALUE_ID] => [VALUE] => [DESCRIPTION] => [VALUE_ENUM] => [VALUE_XML_ID] => [VALUE_SORT] => [
Высокоэффективный капиллярный электрофорез P/ACE MDQ
Фирма Beckman Coulter создала свой первый прибор высокоэффективного капиллярного электрофореза в 1989 году и начала им серию P/ACE . Уже тогда было применено много эффективных инженерных решений (картридж для капилляра с водяным охлаждением, микропрепаративный коллектор фракций и т .д ), делающих прибор не только передовым словом технологии, но также надежным и удобным. Beckman Coulter является признанным лидером в области технологии капиллярного электрофореза. Фирма постоянно развивает и внедряет новые возможности в оборудование, программное обеспечение и наборы реактивов. К таким новшествам относятся лазерный флуориметрический детектор (LIF), детектор диодная матрица, независимое термостатирование буферов и образца, интерфейс для подключения внешних детекторов и др.
Система капиллярного электрофореза P/ACE MDQ применяется и конфигурируется для исследований, создания стандартных методов и контроля качества. Капиллярный электрофорез позволяет проводить качественный, количественный анализ и анализ примесного состава.
Система имеет модульную структуру и сменные детекторы. Стандартно прибор может комплектоваться УФ/Вид, диодно-матричным и LIF детекторами. С использованием стандартного внешнего интерфейса может подключаться любой дополнительный внешний детектор (например, массспектрометрический ).
Предлагаемая фирмой BECKMAN система капиллярного электрофореза P/ACE MDQ в сочетании с готовыми наборами реактивов и капилляров позволяет успешно решать самые разнообразные аналитические задачи, в том числе разделение белков, олигонуклеотидов и фрагментов ДНК, разделение энантиомеров и низкомолекулярных веществ (витаминов, аминокислот, антибиотиков и др.), определение структуры олигосахаридов и многое другое.
В этом высокопроизводительном приборе для разработки новых методик анализа лекарственных веществ и контроля качества фармацевтической продукции, образцы размещаются в 96-луночных планшетах, буферы — в кри о- или микропробирках . Все исследования полностью автоматизированы. Два сменных детектора — УФ-детектор и детектор на основе диодной матрицы.
Сравнительно новый аналитический метод. В практике с 1989 года.
Является дополнением или альтернативой Высокоэффективной жидкостной хроматографии и в значительной мере гель-электрофорезу
В области медицинской диагностики капиллярный электрофорез это прибор позволяющий контролировать уровень медикаментов в крови, моче, ЦСЖ или слюне при минимальной пробоподготовке или вообще без нее, производить анализ катехоламинов и других биогенных аминов крови и мочи .( в комплекте с лазерным флуориметром ). А также производить:
-Анализ белков крови и мочи.
-Определение гликозилированного гемоглобина при сахарном диабете.
-Аномальных гемоглобинов при талассемии и сходных заболеваниях.
-Анализ липопротеинов крови.
-Анализ биологически активных пептидов в крови и моче.
-Изоферментов креатинфосфокиназы , щелочной фосфатазы, и т.п.
Как прибор для контроля качества медикаментов и пищевых веществкапиллярный электрофорез идеален из-за минимальной пробоподготовки , крайней устойчивости к посторонним примесям в пробе и низкой себестоимости анализа.
Капиллярный электрофорез это единственный в своем роде способ разделения энантиомеров в силу крайней экономичности и большей разрешающей способности по сравнению с НР LC
Высокочувствительный лазерный флуориметр и наборы для DNA позволяют крайне эффективно производить HLA-типирование и идентификацию личности по STR участкам ДНК, другие работы с ДНК и РНК. Прекрасное дополнение ПЦР!
Стандартные интерфейсы позволяют легко подключить прибор к масс-спектрометру. Такой прибор просто незаменим в научной работе, службе СЭС, криминалистике и при допин г- контроле.
Работа на капиллярном электрофорезе имеет следующие достоинства :
— Практически не требуется специализированных реагентов.
— Основным расходным материалом являются буферные соли — бораты, фосфаты, ацетаты, SDS, NaOH 0,1моль/л и HCL 0,1моль/л, флуоресцентный маркер, если работе ведется с лазером, и капилляр.
— Капилляр многоразовый и служит дольше колонки HPLC, легче регенерируется и стоит 5 раз дешевле.
— Разрешающая способность капилляра значительно выше
— Даже при очень интенсивной работе расходуется 10-20 миллилитров буфера в день.
— Все буферные растворы легко изготавливаются в любой лаборатории,
— Рабочая чувствительность при комплектации лазерным флуориметром достигает -12М
— Специальные микропробирки позволяют работать с пробами по 5-10 мкл. На анализ забирается не более — 0,1мкл пробы.
— Стандартные пробирки, мини и микро размещаются в одной карусели.
В РЕЗУЛЬТАТЕ ПО СРАВНЕНИЮ С ВЭЖХ:
— Расходы на растворители, реагенты и пробоподготовку в 50-200 раз ниже.
— Трудоемкость в 3-5 раз меньше
— Производительность (проб/день) на 15-20% выше.
— Обслуживание проще (кроме автосамплера нет движущихся деталей)
Beckman использует жидкостное охлаждение капилляра. Охлаждающая жидкость неэлектропроводна , негорюча , нетоксична. Это позволяет использовать капилляры большого внутреннего диаметра (до 200 мкм) для препаративных разделений, большие токи и напряжения для быстрых разделений, использовать высокие (0,1-0,4 моль/л) концентрации солей там где это необходимо
Эти режимы работы невозможны при воздушном охлаждении
Воспроизводимость также выше при жидкостном охлаждении
Прибор оборудован автосамплером , по заказу может быть оборудован холодильником для образцов.
В автосамплере может производиться автоматическая дериватизация проб. В препаративном режиме он же служит коллектором фракций.
Beckman Instruments — предлагает готовые наборы капилляров и реактивов для самых разнообразных разделений.
— для разделения DNA до 100 пар оснований
— для разделения DNA до 1000 пар оснований
— для разделения DNA до 20 000 пар оснований
— для разделения белков в геле SDS-PAAG (14-200 kDa )
— для разделения энантиомеров .
— для разделения белков и пептидов
— для изоэлектрофокусирования белков рН3-10
— для разделения малых молекул (витамины, аминокислоты, антибиотики, антиконвульсанты и др.)
477170 МОДЕЛЬ P/ACE 5000, UV ДЕТЕКТОР
477172 МОДЕЛЬ P/ACE 5500, DAD ДЕТЕКТОР
267845 МОДЕЛЬ P/ACE DNA, UV + LIF ДЕТЕКТОР
267819 МОДЕЛЬ P/ACE DNA, LIF ДЕТЕКТОР
144001 P/ACE MDQ UV ДЕТЕКТОР
144000 P/ACE MDQ DAD ДЕТЕКТОР
477126 LIF488 ДЕТЕКТОР ДЛЯ P/ACE
267838 LIF635 ДЕТЕКТОР ДЛЯ P/ACE
144901 LIF488 ДЕТЕКТОР ДЛЯ MDQ
477430 НАБОР ДЛЯ АНАЛИЗА МАЛЫХ МОЛЕКУЛ Amino
477445 НАБОР ДЛЯ Э/ФОРЕЗА БЕЛКОВ Neutral
477435 НАБОР ДЛЯ Э/ФОРЕЗА БЕЛКОВ Amino
477420 НАБОР ДЛЯ АНАЛИЗА БЕЛКОВ ПО МАССЕ SDS14-200
477490 НАБОР ДЛЯ ИЗОЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЯ БЕЛКОВ
477480 НАБОР ДЛЯ АНАЛИЗА ДНК до 100 оснований
477410 НАБОР ДЛЯ АНАЛИЗА ДНК до 1000 пар оснований
477486 НАБОР ДЛЯ АНАЛИЗА ДНК до 20 000 пар оснований
501300 НАБОР ДЛЯ АНАЛИЗА ОПТИЧЕСКИХ ИЗОМЕРОВ
477600 НАБОР ДЛЯ АНАЛИЗА СТРУКТУРЫ ОЛИГОСАХАРИДОВ
Система P/ACE MDQ имеет ряд особенностей.
— Прибор работает с микроплашками , виалками 2 и 0,5 мл и пробирками для PCR. Может программироваться, как позиция виалки для отбора, так и вывода образца.
— Возможно задавать до 36 пар буферов.
Улучшенный температурный контроль. Патентованная система водяного охлаждения намного эффективнее воздушного. Такая система дополнительно позволяет:
— Использовать буферы большой ионной силы (500 ммоль/л) для улучшения разделения сложных смесей
— Использовать капилляры большого диаметра (150-200 мкм) для увеличения объема вводимой пробы и улучшения чувствительности.
— Улучшает воспроизводимость времени миграции
Опция термостатирования образца от 5 до 60°C позволяет работать с термонестабильными соединениями
Система ввода позволяет работать в трех режимах ввода пробы: вакуум, давление, электрокинетическая инжекция
Модульная система позволяет легко менять и подключать внешние детекторы
Валидация – специальное программное обеспечение, тестовые смеси и точное оборудование позволяют проводить валидации в соответствии с GLP и CGMP.
Простое и интуитивно понятное программное обеспечение 32 Carat под управлением операционной системы Windows позволяет легко управлять прибором, собирать и обрабатывать данные. Программное обеспечение специально ориентировано на капиллярный электрофорез и при обработке учитывает особенности данного аналитического метода.
Выпускается ряд стандартных систем оптимизированных под решение конкретных задач. К ним поставляются стандартные наборы реагентов.
источник