Метод электрофореза был предложен

1. Зональный электрофорез — полуколичественный метод, позволяющий разделить смесь белков в зависимости от их молекулярной массы и электрического заряда. Суть метода заключается в следующем: исследуемую смесь белков на носителе (например, пластине с гелем) помещают в камеру для электрофореза, заполненную буферным раствором и подключенную к источнику постоянного тока. При электрофорезе белков сыворотки обычно получается 5 основных полос, которые соответствуют фракциям альбумина, альфа₁-, альфа₂-, бета- и гамма-глобулинов (см. рис. 20.1). Иммуноглобулины мигрируют преимущественно во фракцию гамма-глобулинов, хотя также присутствуют во фракциях бета- и альфа₂-глобулинов. Относительное содержание каждой фракции сывороточных белков можно оценить с помощью денситометра. С помощью зонального электрофореза можно исследовать не только сыворотку, но и другие биологические жидкости, например СМЖ и мочу. Этот метод позволяет оценить белковый состав исследуемой пробы и выявить моноклональные антитела, хотя он недостаточно чувствителен для определения моноклональных антител в низкой концентрации на ранних стадиях миеломной болезни.

2. Иммуноэлектрофорез. Суть метода заключается в следующем: 1) проводят электрофоретическое разделение белков в геле; 2) по окончании электрофореза в геле параллельно направлению электрофореза вырезают бороздки; 3) в бороздки вносят антитела (антисыворотку), например к тяжелым (альфа, дельта, эпсилон, гамма, мю) или легким (лямбда, каппа) цепям иммуноглобулинов. Эти антитела и разделенные при электрофорезе белки диффундируют навстречу друг другу. В тех местах, где антитела связываются с белками, образуются дуги преципитации (см. рис. 20.2). Иммуноэлектрофорез позволяет оценить лишь качественный состав исследуемой смеси белков. Оценка результатов исследования требует высокой квалификации. Чаще всего этот метод применяется для выявления и характеристики моноклональных антител.

3. Электрофорез с иммунофиксацией. Этот метод основан на электрофоретическом разделении белков сыворотки в геле с последующей инкубацией геля в присутствии антител к тяжелым и легким цепям иммуноглобулинов. При связывании белков с антителами образуются иммунные комплексы, которые можно увидеть после окрашивания (см. рис. 20.3). Иммунные комплексы, содержащие нормальные иммуноглобулины, откладываются в виде широкой, размытой полосы, моноклональные — в виде более узкой и четко очерченной. Этот метод также является качественным, однако более чувствителен и прост, чем иммуноэлектрофорез. Электрофорез с иммунофиксацией часто применяется в сочетании с иммуноэлектрофорезом для определения моноклональных или олигоклональных иммуноглобулинов.

Б. Двойная радиальная иммунодиффузия — полуколичественный метод, с помощью которого можно не только выявить антигены, но и оценить степень сходства между ними. Суть метода заключается в следующем: 1) в лунки, вырезанные в агаре, вносят исследуемую смесь антигенов и антитела с известной специфичностью (обычно в центральную лунку вносят антитела, а в расположенные вокруг нее — антигены); 2) антигены и антитела диффундируют по направлению друг к другу; 3) в том месте, где произошло связывание антител и антигенов, образуются полосы преципитации. По взаимному расположению и форме полос преципитации можно оценить степень сходства между антигенами, находящимися в соседних лунках. В настоящее время этот метод применяется в диагностике аутоиммунных заболеваний для выявления аутоантител к экстрагируемым ядерным антигенам (см. гл. 15, п. II.Д.2). Хотя по чувствительности метод двойной радиальной иммунодиффузии уступает многим количественным методам, технически он прост, не требует высокоочищенных антител, специфичен и может использоваться при проведении массовых исследований.

В. Простая радиальная иммунодиффузия позволяет количественно определить содержание антигена в исследуемой пробе. Суть метода заключается в следующем. В слое агара, содержащего антитела, вырезают лунки, в одни из которых вносят исследуемый антиген, в другие — стандартный. Антигены диффундируют из лунок в агар, образуя радиальные зоны преципитации. Диаметр зоны преципитации пропорционален концентрации антигена. Это простой и надежный метод количественной оценки иммуноглобулинов (включая подклассы IgG), компонентов комплемента (например, C3, C4, фактора B) и других белков сыворотки. Существуют готовые наборы, позволяющие определить антиген в низкой концентрации — не более 3 мкг/мл. Определяя содержание иммуноглобулинов, необходимо учитывать, что изменение их свойств может искажать результаты исследования. Так, если в сыворотке содержатся мономерные IgM (например, при макроглобулинемии Вальденстрема, атаксии-телеангиэктазии), уровень IgM будет искусственно завышен, поскольку мономерный IgM диффундирует быстрее, чем пентамерный. Присутствие ревматоидного фактора в исследуемой пробе, напротив, искусственно снижает уровень IgG, поскольку иммунные комплексы, состоящие из IgG и ревматоидного фактора, диффундируют медленнее, чем несвязанный IgG. Сыворотка многих больных с дефицитом IgA содержит антитела к белкам животного происхождения, например к козьим иммуноглобулинам, поэтому при использовании козьих антител для определения уровня IgA в этом случае получаются завышенные результаты.

Г. Нефелометрия — определение концентрации взвешенных частиц и высокомолекулярных веществ в растворе, основанное на оценке интенсивности рассеяния света, проходящего через этот раствор. Нефелометрия может быть использована для определения концентрации антигенов, поскольку при добавлении к ним антител образуются иммунные комплексы, рассеивающие проходящий свет. Нефелометрия позволяет с высокой точностью определить концентрацию IgG, IgA, IgM, подклассов IgG, C3, C4, фактора B, C-реактивного белка и некоторых других сывороточных белков. Этот метод подходит для определения белков в низкой концентрации, например IgE, уровень которого в сыворотке не превышает 1 мкг/мл. В настоящее время многие лаборатории используют нефелометрию в качестве стандартного метода количественного определения иммуноглобулинов.

Д. РИА. Этот высокочувствительный метод разработан более 30 лет назад и сначала использовался для определения концентрации инсулина и других гормонов. Сейчас он используется и для определения антигенов и антител. Существует несколько модификаций метода. Одна из них основана на конкурентном связывании меченного радиоактивным изотопом и немеченого антигена с антителами. Суть метода заключается в следующем: 1) известное количество антител смешивают с известным количеством меченого антигена и исследуемой пробой (содержащей неизвестное количество антигена); 2) антиген, содержащийся в пробе, и стандартный меченый антиген связываются с антителами, 3) чем выше содержание немеченого антигена, тем меньше меченого антигена свяжется с антителами (см. рис. 20.4). Концентрацию антигена в исследуемой пробе оценивают по уровню радиоактивности иммунных комплексов. Тот же подход может быть использован для определения концентрации антител в пробе. В этом случае известное количество антигена смешивают с известным количеством стандартных меченых антител и исследуемой пробой (содержащей неизвестное количество антител). Другая модификация метода основана на иммобилизации антигена или антитела на твердой подложке (см. гл. 20, п. I.Е). Основные недостатки метода — необходимость дорогостоящего оборудования и реактивов, а также условий для работы с радиоактивными изотопами.

Е. Твердофазный ИФА. В качестве твердой фазы чаще всего используются полистироловые планшеты с сорбированными на них антигенами или антителами. Определение антител к какому-либо антигену проводят следующим образом: 1) исследуемую жидкость вносят в лунки планшета с сорбированным на них антигеном; 2) во время инкубации антитела связываются с антигеном; 3) планшет отмывают от несвязавшихся антител и добавляют антитела к иммуноглобулинам (вторые антитела), меченные ферментом; 4) планшет вновь отмывают, добавляют субстрат фермента и хромоген (вещество, меняющее окраску в процессе химической реакции); 5) под действием продукта ферментативной реакции хромоген меняет окраску. Чем больше меченных ферментом вторых антител связывается с комплексами антиген—антитело, тем выше активность фермента и интенсивность окраски раствора (см. рис. 20.5). Концентрацию антител в пробе определяют спектрофотометрически — по оптической плотности окрашенного раствора. Такой же подход применяется для определения антигена в пробе. В этом случае используются планшеты с сорбированными антителами к исследуемому антигену, меченные ферментом вторые антитела также направлены к этому антигену (см. рис. 20.5). Твердофазный ИФА применяют для количественной оценки антител и антигенов. По чувствительности он сопоставим с РИА, но более прост, дешев и не требует применения радиоактивных изотопов. Многие лаборатории используют твердофазный ИФА в качестве стандартного метода определения противовирусных антител, включая антитела к ВИЧ, цитокинов и иммуноглобулинов (IgE и подклассов IgG).

Ж. Иммуноблоттинг — качественный метод, позволяющий выявлять антигены и антитела в исследуемой пробе. Антитела с помощью этого метода выявляют следующим образом: 1) смесь известных антигенов разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и переносят на нитроцеллюлозную мембрану; 2) мембрану инкубируют с исследуемой пробой, например сывороткой, а затем — с мечеными антителами к иммуноглобулинам. Для выявления антигенов электрофоретическому разделению подвергаются белки исследуемой пробы, которые затем переносятся на мембрану с последующим добавлением меченых антител к известным антигенам. В настоящее время выпускаются готовые наборы для проведения иммуноблоттинга. Этот метод широко применяется для подтверждения результатов твердофазного ИФА при диагностике ВИЧ-инфекции.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

Электрофорез — метод разделения веществ, основанный на явлении миграции заряженных микрочастиц в жидкой среде под действием внешнего электрического поля.

Существует три различных электрофоретических метода. Под собственно электрофорезом обычно понимают зональный электрофорез (ЗЭ), два других называют методами изоэлектрофокусирования (ИЭФ)и изотахофореза (ИТФ).Электрофорез применяют главным образом для разделения веществ, молекулы которых различаются по электрофоретической подвижности, т. е. отношению скорости электрофореза (скорости перемещения заряженных частиц вещества) к напряженности электрического поля, которое зависит от свойств заряженных частиц окружающей их среды. Путем изменения внешних условий (например, рН среды, температуры, силы тока, состава и концентрации буферного раствора или носителя) создают подходящие условия для разделения. Вследствие того что при разделении на молекулы действуют только электростатические силы, электрофорез считают «мягким» методом и поэтому часто применяют для работы с лабильными веществами.

Электрофорез можно проводить в растворе, но из-за неизбежного выделения теплоты и возникающей в связи с этим тепловой конвекции процесс, как правило, проводят на носителе. Вследствие некоторых сопутствующих явлений (адсорбция, несоизмеримость размеров высокомолекулярных соединений и пор носителя) введение носителя ограничивает область применения метода. Однако свойства носителя иногда используют для повышения эффективности разделения: например, при электрофорезе в градиенте полиакриламидного геля фракционирование осуществляется не столько за счет различной электрофоретической подвижности веществ, сколько за счет различия в их молекулярных массах.

Зональный электрофорез (ЗЭ) — это метод разделения заряженных частиц в электрическом поле, основанный на том, что частицы с разными соотношениями заряд/масса мигрируют с различными скоростями. В зависимости от знака заряда молекулы вещества мигрируют в электрическом поле по направлению к аноду или катоду.

Результаты этого процесса регистрируются на электрофореграфе (по аналогии с хроматографией).

Ранее использовали один и тот же буфер в слое носителя электродных камерах, т. е. разделение вели в непрерывной буферной системе. В настоящее время этот прием еще применяют при электрофорезе на бумаге и пластинках. Приэлектрофорезе в прерывистой буферной системе (различные буферы в слое носите электродных камерах) быстро мигрирующие вещества образую более узкие зоны. Электрофорез в прерывистой буферной системе используют главным образом в гель-электрофорезе. ЗЭ обычно проводят на бумаге, пластинках и в гелях в водных буферных растворах.

При электрофорезе в электродных камерах происходит электролиз раствора и вследствие этого изменяется состав буфера. Поэтому электроды располагают так, чтобы они не касались носителя, а контакт между ними осуществлялся при помощи полосок фильтровальной бумаги. Электродная камера разделена на два отсека, которые соединяются дополнительным мостиком из фильтровальной бумаги. Подбирая соответствующий объем электродных камер или перекачивая буфер насосом от анода к катоду, поддерживают постоянными концентрацию и значение рН буфера в двухкамерной системе. Рекомендуется также проводить деполяризации электродов после каждого электрофоретического разделения.

Материалы-носители подразделяются на две группы:

первая — бумага, целлюлоза, ацетилированная целлюлоза, агароза и материалы для ТСХ(например, силикагель);

вторая — крахмал и полиакриламид.

Эффективность разделения зависит не только от суммарного заряда молекул анализируемых веществ, но и от размеров молекул. Определяющим параметром является соотношение заряд — масса.

Носители первой группы относительно инертны и слабо влияют на эффективность разделения. Материалы второй группы обладают пористой структурой, что существенно влияет на качество разделения. Поскольку размеры пор соизмеримы с размером макромолекул, то можно разделять вещества с одинаковыми суммарными зарядами, но с разными молекулярными массами (например, при ионообменной хроматографии).

Электрофорез на бумаге позволяет экстрагировать вещества из соответствующих зон или пятен и использовать для дальнейшей работы; обнаруживать вещества, используемые в бумажной хроматографии; проводить фракционирование в двух направлениях.

Для электрофореза на бумаге используют специальные сорта бумаги, характеризующиеся следующими свойствами: достаточной механической прочностью; удовлетворительным для удерживания достаточного количества электролита и образца.

Наряду с камерами погружного типа применяют камеры для электрофореза в тонком слое с охлаждаемыми пластинами, в которых лист бумаги помещают между двумя изолирующими пленками.

Электрофорез в тонком слое проводят на стеклянных пластинках, покрытых слоем носителя. По сравнению с полосками бумаги пластины более удобны в обращении. Электрофорез на бумаге и в тонком слое применяют для исследования фракций, полученных при колоночной хроматографии, ферментативных гидролизатов белков, метаболитов, а также для разделения аминов, аминокислот, пептидов и белков, нуклеотидов, фенолов, нафтолов, фенолкарбоновых кислот, красителей, неорганических соединений.

Гель- электрофорез. Вместо целлюлозы и силикагеля можно использовать мягкие гели. Ниже приведены основные рабочие стадии проведения электрофореза в слое геля: приготовление гелей и подготовка образца ® электрофоретическое разделение ® детектирование ® анализ результатов и оформление их в рабочем журнале. Из множества гелей на практике применяют только два — гели агарозы и полиакриламида. В зависимости от способа приготовления геля и типа буферной системы различают несколько вариантов метода:

· электрофорез в геле полиакриламида (ПААГ);

· диск-электрофорез (диск-ПААГ) в прерывистой буферной системе;

· электрофорез в геле полиакриламида в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ);

· электрофорез в градиенте пористого полиакриламидного геля.

Гель окрашивают красителем. Поскольку молекулы красителя заряжены, гель можно обесцвечивать электрофоретически при напряжении 50 В. В местах, не содержащих исследуемое вещество, гель обесцвечивается. Количественную оценку проводят спектрофотометрически при помощи сканирующего денситометра.

После усадки гелей в водном этаноле или ацетоне их высушивают между двумя листами целлофана в вакууме при слабом нагреве.

Гель-электрофорез применяют для разделения всех классов заряженных веществ, например белков, ферментных комплексов, вирусов, олигонуклеотидов и нуклеиновых кислот; определения молекулярных масс биополимеров; анализа белков на микроуровне (антигенов при количественном иммуноэлектрофорезе).

При электрофорезе в свободном потоке электролит (буфер) перемещается в вертикальном направлении (перпендикулярно направлению электрического поля). Заряженные частицы под действием электрического поля мигрируют в горизонтальном направлении и одновременно увлекаются потоком буфера. В итоге разделенные вещества распределяются в потоке в соответствии с их электрофоретической подвижностью и элюируются из прибора в различных фракциях. Электрофорез в свободном потоке применяют для препаративного разделения заряженных частиц, в том числе коллоидных, субклеточных частиц и клеток.

Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ). С помощью изоэлектрического фокусирования по изоэлектрическим точкам (ИЭТ) разделяют амфотерные вещества, в частности белки. Сущность метода заключается в том, что молекулы белков мигрируют под действием электрического поля в среде с линейным и стабильным градиентом рН до достижения области рН, соответствующей их ИЭТ.

Изоэлектрическое фокусирование отличается от зонального электрофореза тем, что разделение осуществляется не в буфере с постоянным значением рН, а в среде с линейным градиентом рН. Значение рН минимально вблизи анода, максимально — вблизи катода. Главное условие эффективного разделения белков — наличие стабильного градиента рН среды. В связи с тем что белки обладают амфотерными свойствами, необходимо, чтобы амфолиты – носители — вещества, с помощью которых формируется градиент рН, обладали высокой буферной емкостью. Амфолиты — носители представляют собой многокомпонентную смесь изомеров и гомологов алифатических полиаминополикарбоновых кислот, сульфокислот и фосфоновых кислот, изоэлектрические точки которых располагаются в широкой области значений рН.

ИЭФ применяют для аналитического разделения пептидов, белков, нуклеотидов, органических кислот, ионов металлов и препаративного разделения белков; накопления следовых количеств веществ из больших объемов пробы; определения электрофоретической подвижности.

Необходимым условием проведения ИЭФ является наличие высокого напряжения при низкой ионной силе раствора. Однако именно в этих условиях усиливается электроосмос. Отрицательное воздействие на эффективность разделения веществ оказывают так же примеси солей, занесенные вместе с реактивами (гели для ИЭФ следует готовить из особо чистых реактивов). Для проведения ИЭФ более всего подходит полиакриламидный гель с низкими электроосмотическими свойствами. Продолжительность эксперимента зависит от напряженность поля и характера изменения рН- градиента.

Препаративное изоэлектрическое фокусирование проводят в вертикальных колонках (в градиенте плотности сахарозы, глицерина, этиленгликоля) или в слое инертного материала. В качестве таких материалов используют гранулированные гели (рН градиент формируют с помощью амфолитов).

источник

Что такое клинические исследования и зачем они нужны? Это исследования, в которых принимают участие люди (добровольцы) и в ходе которых учёные выясняют, является ли новый препарат, способ лечения или медицинский прибор более эффективным и безопасным для здоровья человека, чем уже существующие.

Главная цель клинического исследования — найти лучший способ профилактики, диагностики и лечения того или иного заболевания. Проводить клинические исследования необходимо, чтобы развивать медицину, повышать качество жизни людей и чтобы новое лечение стало доступным для каждого человека.

У каждого исследования бывает четыре этапа (фазы):

I фаза — исследователи впервые тестируют препарат или метод лечения с участием небольшой группы людей (20—80 человек). Цель этого этапа — узнать, насколько препарат или способ лечения безопасен, и выявить побочные эффекты. На этом этапе могут участвуют как здоровые люди, так и люди с подходящим заболеванием. Чтобы приступить к I фазе клинического исследования, учёные несколько лет проводили сотни других тестов, в том числе на безопасность, с участием лабораторных животных, чей обмен веществ максимально приближен к человеческому;

II фаза — исследователи назначают препарат или метод лечения большей группе людей (100—300 человек), чтобы определить его эффективность и продолжать изучать безопасность. На этом этапе участвуют люди с подходящим заболеванием;

III фаза — исследователи предоставляют препарат или метод лечения значительным группам людей (1000—3000 человек), чтобы подтвердить его эффективность, сравнить с золотым стандартом (или плацебо) и собрать дополнительную информацию, которая позволит его безопасно использовать. Иногда на этом этапе выявляют другие, редко возникающие побочные эффекты. Здесь также участвуют люди с подходящим заболеванием. Если III фаза проходит успешно, препарат регистрируют в Минздраве и врачи получают возможность назначать его;

IV фаза — исследователи продолжают отслеживать информацию о безопасности, эффективности, побочных эффектах и оптимальном использовании препарата после того, как его зарегистрировали и он стал доступен всем пациентам.

Считается, что наиболее точные результаты дает метод исследования, когда ни врач, ни участник не знают, какой препарат — новый или существующий — принимает пациент. Такое исследование называют «двойным слепым». Так делают, чтобы врачи интуитивно не влияли на распределение пациентов. Если о препарате не знает только участник, исследование называется «простым слепым».

Чтобы провести клиническое исследование (особенно это касается «слепого» исследования), врачи могут использовать такой приём, как рандомизация — случайное распределение участников исследования по группам (новый препарат и существующий или плацебо). Такой метод необходим, что минимизировать субъективность при распределении пациентов. Поэтому обычно эту процедуру проводят с помощью специальной компьютерной программы.

бесплатный доступ к новым методам лечения прежде, чем они начнут широко применяться;
качественный уход, который, как правило, значительно превосходит тот, что доступен в рутинной практике;
участие в развитии медицины и поиске новых эффективных методов лечения, что может оказаться полезным не только для вас, но и для других пациентов, среди которых могут оказаться члены семьи;
иногда врачи продолжают наблюдать и оказывать помощь и после окончания исследования.

новый препарат или метод лечения не всегда лучше, чем уже существующий;
даже если новый препарат или метод лечения эффективен для других участников, он может не подойти лично вам;
новый препарат или метод лечения может иметь неожиданные побочные эффекты.

Главные отличия клинических исследований от некоторых других научных методов: добровольность и безопасность. Люди самостоятельно (в отличие от кроликов) решают вопрос об участии. Каждый потенциальный участник узнаёт о процессе клинического исследования во всех подробностях из информационного листка — документа, который описывает задачи, методологию, процедуры и другие детали исследования. Более того, в любой момент можно отказаться от участия в исследовании, вне зависимости от причин.

Обычно участники клинических исследований защищены лучше, чем обычные пациенты. Побочные эффекты могут проявиться и во время исследования, и во время стандартного лечения. Но в первом случае человек получает дополнительную страховку и, как правило, более качественные процедуры, чем в обычной практике.

Клинические исследования — это далеко не первые тестирования нового препарата или метода лечения. Перед ними идёт этап серьёзных доклинических, лабораторных испытаний. Средства, которые успешно его прошли, то есть показали высокую эффективность и безопасность, идут дальше — на проверку к людям. Но и это не всё.

Сначала компания должна пройти этическую экспертизу и получить разрешение Минздрава РФ на проведение клинических исследований. Комитет по этике — куда входят независимые эксперты — проверяет, соответствует ли протокол исследования этическим нормам, выясняет, достаточно ли защищены участники исследования, оценивает квалификацию врачей, которые будут его проводить. Во время самого исследования состояние здоровья пациентов тщательно контролируют врачи, и если оно ухудшится, человек прекратит своё участие, и ему окажут медицинскую помощь. Несмотря на важность исследований для развития медицины и поиска эффективных средств для лечения заболеваний, для врачей и организаторов состояние и безопасность пациентов — самое важное.

Потому что проверить его эффективность и безопасность по-другому, увы, нельзя. Моделирование и исследования на животных не дают полную информацию: например, препарат может влиять на животное и человека по-разному. Все использующиеся научные методы, доклинические испытания и клинические исследования направлены на то, чтобы выявить самый эффективный и самый безопасный препарат или метод. И почти все лекарства, которыми люди пользуются, особенно в течение последних 20 лет, прошли точно такие же клинические исследования.

Если человек страдает серьёзным, например, онкологическим, заболеванием, он может попасть в группу плацебо только если на момент исследования нет других, уже доказавших свою эффективность препаратов или методов лечения. При этом нет уверенности в том, что новый препарат окажется лучше и безопаснее плацебо.

Согласно Хельсинской декларации, организаторы исследований должны предпринять максимум усилий, чтобы избежать использования плацебо. Несмотря на то что сравнение нового препарата с плацебо считается одним из самых действенных и самых быстрых способов доказать эффективность первого, учёные прибегают к плацебо только в двух случаях, когда: нет другого стандартного препарата или метода лечения с уже доказанной эффективностью; есть научно обоснованные причины применения плацебо. При этом здоровье человека в обеих ситуациях не должно подвергаться риску. И перед стартом клинического исследования каждого участника проинформируют об использовании плацебо.

Обычно оплачивают участие в I фазе исследований — и только здоровым людям. Очевидно, что они не заинтересованы в новом препарате с точки зрения улучшения своего здоровья, поэтому деньги становятся для них неплохой мотивацией. Участие во II и III фазах клинического исследования не оплачивают — так делают, чтобы в этом случае деньги как раз не были мотивацией, чтобы человек смог трезво оценить всю возможную пользу и риски, связанные с участием в клиническом исследовании. Но иногда организаторы клинических исследований покрывают расходы на дорогу.

Если вы решили принять участие в исследовании, обсудите это со своим лечащим врачом. Он может рассказать, как правильно выбрать исследование и на что обратить внимание, или даже подскажет конкретное исследование.

Клинические исследования, одобренные на проведение, можно найти в реестре Минздрава РФ и на международном информационном ресурсе www.clinicaltrials.gov.

Обращайте внимание на международные многоцентровые исследования — это исследования, в ходе которых препарат тестируют не только в России, но и в других странах. Они проводятся в соответствии с международными стандартами и единым для всех протоколом.

После того как вы нашли подходящее клиническое исследование и связались с его организатором, прочитайте информационный листок и не стесняйтесь задавать вопросы. Например, вы можете спросить, какая цель у исследования, кто является спонсором исследования, какие лекарства или приборы будут задействованы, являются ли какие-либо процедуры болезненными, какие есть возможные риски и побочные эффекты, как это испытание повлияет на вашу повседневную жизнь, как долго будет длиться исследование, кто будет следить за вашим состоянием. По ходу общения вы поймёте, сможете ли довериться этим людям.

Если остались вопросы — спрашивайте в комментариях.

источник

Метод электрофореза в геле использует разницу в размере и заряде различных молекул в образце. Образец ДНК или белка, подлежащий разделению, погружают в пористый гель, помещенный в ионную буферную среду. При приложении электрического поля каждая молекула, имеющая разный размер и заряд, будет проходить через гель с разной скоростью.

Пористый гель, используемый в этой технике, действует как молекулярное сито, которое отделяет большие молекулы от более мелких. Меньшие молекулы движутся быстрее по гелю, а более крупные медленнее. Подвижность частиц также определется их индивидуальным электрическим зарядом. Два противоположно заряженных электрода, которые являются частью системы, тянут молекулы к себе на основе их заряда.

Гель, используемый в геле-электрофорезе, обычно изготавливают из материала, называемого агарозой, который представляет собой желатиновое вещество, экстрагированное из водорослей. Этот пористый гель можно использовать для отделения макромолекул разных размеров. Гель погружают в раствор солевого буфера в камеру электрофореза. Трис-борат-ЭДТА (ТВЭ) обычно используется в качестве буфера. Его основная функция — контролировать pH системы. Камера имеет два электрода — один положительный и другой отрицательный — на двух концах.

Образцы, которые необходимо проанализировать, затем загружают в маленькие лунки в геле с помощью пипетки. По завершении загрузки применяется электрический ток 50-150 В. Теперь заряженные молекулы, присутствующие в образце, начинают мигрировать через гель к электродам. Отрицательно заряженные молекулы движутся к положительному электроду, а положительно заряженные молекулы мигрируют к отрицательному электроду.

Скорость, с которой каждая молекула перемещается через гель, называется ее электрофоретической подвижностью и определяется главным образом ее чистым зарядом и размером. Сильно заряженные молекулы движутся быстрее, чем слабо заряженные. Меньшие молекулы работают быстрее, оставляя более крупные. Таким образом, сильный заряд и малый размер увеличивают электрофоретическую подвижность молекулы, а слабый заряд и большие размеры уменьшают подвижность молекулы. Когда все молекулы в образце имеют одинаковый размер, разделение будет основываться исключительно на их размере.

источник

Электрофорез

2. Электрофорез с подвижной границей.

4. Изоэлектрическая фокусировка.

Белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды, находясь в растворе несут определенный электрический заряд благодаря наличию групп, способных к электролитический диссоциации. Общий заряд данной частицы определяется, прежде всего, концентрацией Н + -ионов в среде. Под действием электрического тока заряженные частицы перемещаются к катоду или аноду в зависимости от знака их суммарного заряда. Такое явление носит название электрофореза. Скорость движения частиц (см/с) при напряженности электрического поля 1 В/см называется электрофоретической подвижностью.Она имеет размерность см 2 /с -1 ·в -1 .

Различия в подвижности частиц служат основой для разделения смесей веществ.

Если приложить к электропроводящему раствору равномерное электрическое поле (Е), то на частицу будет действовать сила ускорения:

где d– расстояние между электродами, q – заряд молекулы. Так как молекула перемещается не в вакууме, то на неё действует противоположно направленная сила трения, которая зависит от размеров, формы молекулы, вязкости среды и описывается уравнением Стокса:

где f– коэффициент трения, v – скорость движения молекулы. Для сферических частиц коэффициент трения равен 6πηr, где r – радиус частиц и η – коэффициент вязкости растворителя. В растворе силе ускорения противодействует сила трения, поэтому:

Е/d·q = 6πηrv, преобразуя выражение, получим:

Таким образом, скорость молекулы (v) пропорциональна напряженности электрического поля Е/d и заряду молекулы и обратно пропорциональна размеру молекулы и вязкости среды. Заряд и размер являются строго индивидуальными характеристиками молекулы. Следовательно, и путь, который пройдет та или иная молекула при электрофорезе за определенный интервал времени, тоже будет характерен для данной молекулы.

Существуют три основных типа электрофоретических систем – электрофорез с подвижной границей, зональный электрофорез и стационарный электрофорез.

Элекрофорез с подвижной границей

Электрофорез макромолекул, растворенных в буфере с соответствующим значением рН, проводится в V-образной кювете с прямоугольным поперечным сечением. Раствор макромолекул в буфере заливают в нижнюю часть кюветы, доливают оба конца трубки тем же буфером и монтируют в них электроды. Если вести электрофорез в щелочном буфере, то все белки заряжаются отрицательно и начинают перемещаться к аноду: скорость перемещения данного белка зависит от его рН, и от величины суммарного заряда при данном рН буфера. Как видим, в данном методе электрическое поле прикладывается к исходно разной границе между раствором молекул и буфером. Скорость миграции заряженных частиц определяется путем наблюдения за перемещением этой границы. Если раствор содержит гетерогенную смесь ионизированных макромолекул, то можно увидеть множество движущихся границ. Способы наблюдения за пограничными изменениями концентрации вещества основаны на измерении градиента показателя преломления, который пропорционален градиенту концентрации.

Сконструирование Филпонтом и Свенссоном астигматической фотокамеры со специальной оптической системой, называемой шлирен-оптикой, позволяет непосредственно регистрировать градиент показателя преломления вдоль кюветы.

Электрофорез по методу подвижной границы нашел широкое применение при исследовании белков. Этот метод в основном используется для определения подвижностей и изоэлектрических точек белков, т.к. количественно трудно оценить подвижности. Метод электрофореза с подвижной границей используется редко.

Зональный элекрофорез

В зональном электрофорезе пятно или тонкий слой раствора, нанесенного на полутвердый или гелеобразный материал, помещают в электрическое поле, в результате чего молекулы перемещаются по или через материал носитель. В первую очередь функцией носителя является предотвращение механических воздействий и конвекции, которая происходит в результате температурных или высокой плотности концентрированных растворов.

Однако, носитель может действовать в качестве молекулярного сита, приводя тем самым к хроматографическим эффектам, что может или улучшить разделение, или ухудшать его.

а) электрофорез на бумаге.

В качестве носителя здесь используется фильтровальная бумага, которая должна содержать 96% α-целлюлозы, нерастворимой в концентрированном растворе NaOH. Приборы для электрофореза состоят из двух электродных сосудов и устройства для поддержания полосок фильтровальной бумаги. В качестве электродов обычно применяются платиновые проволоки. Можно использовать и угольные электроды. Для предотвращения чрезмерного испарения всю систему помещают в закрытую камеру, что обеспечивает создание влажной атмосферы.

Перед анализом электрофоретическую бумагу погружают в буферный раствор, слегка промокают между чистыми листами промокательной бумаги, а затем помещают на подставку.

Пробу наносят либо капиллярной пипеткой с закрученным носиком, либо с помощью различных аппликаторов, обеспечивающих быстрое и равномерное нанесение исследуемого раствора.

После нанесения проб к кювете подключают напряжение. Для наблюдения за ходом электрофореза на бумагу наносят пятно определенного стандартного вещества. По окончании процедуры бумагу высушивают при 105-110°С. Макромолекулы затем можно обнаружить при помощи соответствующего метода окрашивания.

Б) электрофорез в ПААГ.

В качестве среды для электрофоретического разделения макромолекул наиболее широкое распространение получил ПААГ, обладающий рядом преимуществ. Среди них можно отметить химическую стабильность, инертность, прозрачность в широком диапазоне длин волн, возможность получения пор с заданной величиной, отсутствием адсорбции. С помощью ПААГ можно разделить вещества с молекулярной массой от 2500 до 2000000 дальтон.

Системы электрофореза в ПААГ можно разделить на две группы по применяемым буферным системам. К первой относятся системы вертикального и горизонтального электрофореза, в которых применяется один тип буфера в электродных камерах и геле. Ко второй группе относятся системы вертикального «диск-электрофореза»: в них используются разные виды буферов (2-3) и гели разной концентрации. Название данного метода происходит от английского слова discontinuty (прерывистый), обозначающего в данном контексте неоднородность электрофоретической среды. Для диск-электрофореза характерны скачкообразные изменения рН, концентрации геля и градиента напряжения.

Прибор для диск-электрофореза состоит из верхнего и нижнего резервуара для электродного буфера и вертикальной стеклянной трубки. Нижняя часть трубки заполняется разделяющим гелем с мелкими порами, которые действуют как молекулярное сито по отношению к изучаемым макромолекулам. Над разделяющим гелем находится концентрирующий гель, имеющий крупные поры и поэтому не обладающий свойствами молекулярного сита, а еще выше расположен стартовый гель, содержащий пробу и краситель, используемый в качестве свидетеля.

Принцип диск-электрофореза основан на эффекте подвижной границы Кольрауша, суть которого состоит в использовании двух разных буферов: в электродных камерах трис-глициновый буфер (рН 8,3) , а в концентрирующих(рН 6,7) и разделяющем гелях(рН 8.9) – трис-НСl. В электродном буфере рН на 1,5-2 единицы выше, чем в концентрирующем. Образец растворяется в том же буфере, который используется в концентрирующем геле. При рН 8,3 глицин находится в виде цвиттериона:

После включения тока все ионы (в том числе белки и краситель) начинают двигаться к аноду в следующей последовательности: Сl — > бромфеноловый синий > белки > глицинат.

Рис. 1. Прибор для диск-электрофореза.

Между ионами хлора и глицината образуется граница раздела. Так как оба эти иона принадлежат к одной и той же электрической системе, то в области глицинатных ионов напряжение, а следовательно, и их скорость, возрастают, а в области ионов хлора напряжение и скорость уменьшаются. Следовательно, замыкающие глицинатные ионы будут стремиться догнать ведущие ионы хлора, а зона белков и красителя, находящаяся между ними, будет сужаться (концентрироваться). Этот процесс происходит в концентрирующем (крупнопористом) геле.

Когда подвижная граница доходит до мелкопористого геля (рН 8,9), то, с одной стороны, подвижность глицинатных ионов возрастает, а с другой – на белки начинает действовать эффект молекулярного сита, и они отстают от подвижной границы. Таким образом, белки попадают в более щелочной трис-глициновый буфер, их отрицательный заряд возрастает, и они разделяются согласно своим индивидуальным характеристикам (заряду, форме молекул, молекулярному весу).

При проведении электрофореза гель полимеризуется непосредственно в стеклянной трубке, которую потом соединяют с сосудами с буфером. Образец суспендируют в концентрированном растворе сахарозы и наносят на поверхность геля в виде тонкого слоя с помощью пипетки. Электрофорез прекращают, когда зона красителя (подвижная граница) проходит 0,8-0,9 длины геля. Затем гель извлекают из трубки и окрашивают специальными красителями обнаружения зон. Каждую зону можно характеризовать по значениям их Rf или по площади пика после денсатометрирования. Диск-электрофоретический метод особенно часто используется для разделения белков.

источник

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ г. СЕМЕЙ

Методическое пособие по теме:

Терапевтическая техника, основанная на применении постоянного тока

Электрофорез и гальванизация в медицинской практике.

Подвижность ионов

Фазыгетерогенной системы придут в движение вследствие взаимодействия с электрическим полем, если к системе приложить постоянную разность потенциалов. Движение частиц дисперсной фазы в электрическом поле по направлению к противоположно заряженному электроду называется электрофорезом. Электрофорез был открыт Ф. Рейссом в 1807 г

Электрофорез это движение взвешенных частиц (пузырьков газа, коллоидных частиц и макромолекул) в жидкости под действием электрического поля. Метод, сочетающий воздействие на организм постоянного тока и введение лекарственных веществ, носит название лечебного электрофореза или ионогальванизации.

Профессор В. Виленский применил постоянный ток в сочетании с лекарственными веществами впервые в России в 1859 году, теоретические обоснования нашли подтверждение в исследованиях физика, невропатолога, психиатра А.Б. Щербака.

Электрофорез получил широкое применение в современной медицине в клинических исследованиях сыворотки крови, желудочного сока, мочи, спинно-мозговой жидкости. Электрофорез применяется в физиотерапии. Обычно применяются два основных метода — макроскопический и микроскопический электрофорез.

Макроскопический электрофорез используются для разделения веществ, находящихся в смеси, и их последующего выделения.

Микроскопический электрофорез используются для изучения подвижности ионов, клеток, частиц в электрическом поле, величины электрокинетического потенциала, а также электрохимических свойств поверхности исследуемых веществ.

Скорость передвижения частиц дисперсной фазы можно найти из уравнения Смолуховского: (1)

где υ — скорость передвижения частиц; ε- диэлектрическая проницаемость дисперсионной среды; Е – градиент потенциала электрического поля; ζ — электрокинетический потенциал; η -коэффициент вязкости дисперсионной среды.

Мы можем применить уравнение (1) для эритроцитов, лейкоцитов, микроорганизмов и других клеток. Электрофоретическая подвижность белковых молекул и коллоидных частиц зависит от их размера и формы. Коэффициент, зависящий от размера и формы частиц, вводится для расчетов в уравнение (1). Уравнение (1) применяется для вычисления величины электрокинетического потенциала. Для этого необходимо знать напряженность внешнего поля, диэлектрическую проницаемость и коэффициент вязкости среды, а также скорость движения дисперсной фазы. Один из методов электрофореза заключается в следующем. Исследуемую дисперсную систему помещают на дно V — образной трубки и наливают в боковые колена чистый буферный раствор. Между исследуемой жидкостью и буферным раствором должна быть отчетливая граница раздела. Электроды, соединенные с источником постоянного тока, погружаются в каждое колено V- образной трубки. Создаваемое электрическое поле вызывает перемещение дисперсной фазы исследуемого раствора, и граница между дисперсной системой и буферным раствором перемещается. Перемещение границы регистрируется с помощью длиннофокусной оптики. Если исследуемая смесь содержит несколько компонентов, то каждый компонент движется со скоростью, пропорциональной величине ξ потенциала. В результате смесь разделяется на ряд функций. При регистрации сигнала получается кривая, имеющая ряд пиков. Высота пиков служит количественным показателем данных функций. Затем выделяются и исследуются отдельные фракции белков кровяной плазмы. Данный метод распространился после разработки техники этого метода Тизелиусом.

На аппарате Тизелиуса можно получить результаты высокой точности, но это сложный и громоздкий прибор.

Рис. 1. Диаграмма электрофоретического анализа по Тизелиусу: I — нормальная сыворотка; II — плазма крови при миэломе; III – сыворотка при нефрозе.

Метод электрофореза на бумаге менее точный, но более простой. Этот метод, предложенный Виландом и Фишером, применяется в настоящее время. Он позволяет разделять белки, нуклеиновые кислоты, стерины и другие биологически важные вещества. Определенное количество исследуемого раствора наносится на специальную фильтровальную бумагу, смоченную буферным раствором. Концы этой полоски бумаги соединяются через ванночки, заполненные буферным раствором. Электроды соединяются с источником постоянного тока и опускаются в ванночки с буферным раствором. Компоненты исследуемой смеси перемещаются при включении тока. Подвижность отдельных компонентов зависит от величины ξ потенциала, в соответствии с уравнением (1). После окончания опыта, исследуемые вещества располагаются на различном расстоянии от линии старта. Ленту бумаги необходимо высушить и окрасить красителем, проявляющим исследуемые вещества. В дальнейшем разделенные компоненты подвергаются количественному анализу. Для разделения и исследования электрохимических свойств коллоидных растворов применяются макроскопические методы электрофореза. Микроскопические методы электрофореза используются для изучения электрохимических свойств суспензий различных клеток: эритроцитов, лейкоцитов, бактерий, половых клеток. Суспензии клеток в небольшом количестве помещаются в специальную камеру, заполненную буферным раствором. В эту камеру вводятся также электроды, соединенные с источником постоянного тока. Под действием электрического поля клетки начинают двигаться к противоположно заряженному электроду. Скорость перемещения клеток определяется с помощью микроскопа, снабженного окулярным микрометром.

Важные данные, характеризующие электрохимические свойства биологических поверхностей, получены с помощью методов электрофореза. Живая протоплазматическая поверхность всегда заряжена отрицательно, все биологические поверхности обладают отрицательным электрокинетическим потенциалом. Это установлено на основе многочисленных экспериментов. Не известно ни одного примера положительного потенциала поверхности живого объекта.

Величина ξ- потенциала может иметь различные значения для разных клеток. У человека она составляет примерно 16,3 мВ. Потенциал эритроцитов очень стабильная величина. Например, нет различий в величине ξ- потенциала эритроцитов у людей различных рас и пола. Различий не наблюдаются также между представителями разных групп крови. Электрофоретическая подвижность эритроцитов не изменяется при ряде заболеваний крови, в том числе при многих формах анемий. Электрохимические свойства поверхности эритроцитов отличаются большой стойкостью и постоянством.

Ученые пришли к выводу, что электрокинетический потенциал эритроцитов обусловлен диссоциацией кислотных групп молекул фосфолипидов (кефалина) на поверхности эритроцитов и не связан с процессами адсорбции белков и ионов. Величина электрокинетического потенциала эритроцитов меняется в том случае, если происходит изменение физико-химического состава самой поверхности клетки. Это наблюдается при некоторых заболеваниях, например гемобластозах, лимфосаркоме. Для других форменных элементов крови ξ- потенциал изучен значительно слабее, чем для эритроцитов. Лейкоциты движутся к аноду при электрофорезе, как и эритроциты, но их подвижность примерно в 2 раза ниже подвижности эритроцитов. Электрофоретическая подвижность лейкоцитов весьма близка к подвижности кварцевых частиц. Явление электрофореза наблюдается при миграции лейкоцитов в воспалительные очаги. Электрокинетические явления могут способствовать миграции лейкоцитов. В воспаленных участках происходят процессы разрушения структур и накопления свободных молекул, главным образом органических кислот, что приводит к сдвигу pH в кислую сторону. В результате этих физико-химических изменений пограничный участок между воспаленной и невоспаленной тканью приобретает избыточный положительный потенциал величиной до 100-150 мВ. А так как лейкоциты обладают отрицательным электрокинетическим потенциалом, то они движутся через стенку капилляра в ткань по направлению к положительно заряженному воспаленному участку.

Бактериальные клетки обладают отрицательным ζ потенциалом, который может меняться в очень широких пределах: от нуля до десятков милливольт. Благодаря этим исследованиям большинство бактерий удалось разделить на две группы.

К первой группе принадлежат бактерии, поверхность которых имеет белковую природу. Диссоциация ионогенных групп белковых молекул обусловливает заряд и ζ- потенциал таких клеток. ζ — потенциал этих клеток меняется при изменении pH среды, так как степень диссоциации ионогенных групп зависит от pH.

Ко второй группе относятся бактерии, поверхность которых состоит из полисахаридов. Заряд клеток в данном случае обусловлен адсорбцией ионов из дисперсионной среды полисахаридами поверхности. Электрофоретическая подвижность таких клеток практически не зависит от pH среды. Однако такое деление оказывается довольно условным, т.к. свойства поверхности бактериальных клеток могут изменяться при изменении внешних условий существования. Так, например, ζ потенциал золотистого стафилококка при обычных условиях культивирования остается постоянным при большом изменении pH среды. Если же бактерии культивируются в среде, богатой глюкозой, то наблюдается зависимость ξ- потенциала от величины pH. Эта зависимость появляется вследствие накопления на поверхности клеток групп белковой природы. Таким образом, знание подвижности ионов, применение метода электрофореза является хорошим средством изучения электрохимических свойств биологических поверхностей: способности к ионизации и способности к адсорбции молекул и ионов.

Проводимость электролитов осуществляется за счет ионов, возникающих при растворении и расщеплении молекул веществ. Молекулы распадаются на положительно заряженные ионы — катионы и отрицательно заряженные ионы — анионы. Явление расщепления растворимого вещества на ионы называется электролитической диссоциацией.

Если два электрода погрузить в электролит и подвести к ним напряжение, то под действием электрического поля ионы с отрицательными зарядами (анионы) будут двигаться к аноду, а ионы с положительными зарядами (катионы)- к катоду. Если разность потенциалов на электродах, расположенных на расстоянии L друг от друга, равна φ₁-φ₂, тогда напряженность электрического поля электролита определяется по формуле E= (φ₁-φ₂)/L

Электрическое поле действует на заряженные частицы с постоянной силой, заставляя их перемещаться к электродам с некоторой постоянной скоростью. Чем больше напряженность, тем быстрее будут перемещаться ионы. Скорость перемещения ионов прямо пропорциональна напряженности электрического поля, υ=υE, где υ, — коэффициент пропорциональности, называемый подвижностью ионов: υ = υ/E

Напряженность электрического поля измеряется в В/м, скорость движения ионов — в м/с. Подвижность ионов определенного вида выражается их скоростью перемещения в растворителе под действием электрического поля и измеряется в

Подвижность различных ионов при одинаковых условиях перемещения зависит от размеров ионов и валентности. Подвижность является величиной характерной для определенного вида ионов. По величине подвижности ионов можно определить вид иона или разделить смесь ионов электролитическим путем.

Лекарственный электрофорез

Лекарственный электрофорез – сочетание воздействия на организм постоянного электрического тока и лекарственного вещества, введенного с его помощью. При этом лечебные эффекты вводимого лекарственного вещества добавляются к механизмам действия постоянного тока. Они зависят от подвижности, способа введения, количества поступающего в организм лекарства и области его введения. Лекарственные вещества в растворе распадаются на ионы и заряженные гидрофильные комплексы. При помещении таких растворов в электрическое поле содержащиеся в них ионы перемещаются по направлению к противоположным электрическим полюсам (электрофорез), проникают в глубь тканей и оказывают лечебное действие. Из прокладки под положительным электродом в ткани организма вводятся ионы металлов (из растворов солей), а также положительно заряженные частицы более сложных веществ; из прокладки под отрицательным электродом – кислотные радикалы, а также отрицательно заряженные частицы сложных соединений.

Проникающая способность ионов лекарственных веществ зависит от их структуры и от степени электролитической диссоциации. Она неодинакова в различных растворителях и определяется их диэлектрической проницаемостью (ε). Растворенные в воде лекарственные вещества имеют большую подвижность в электрическом поле ( ). Водные растворы глицерина ( ) и этилового спирта ( ) используются для диссоциации нерастворимых в воде веществ. Введение лекарственных веществ в ионизированной форме увеличивает их подвижность и усиливает фармакологический эффект. Усложнение структуры препарата уменьшает его подвижность.

Вводимые лекарственные вещества проникают в эпидермис и накапливаются в верхних слоях дермы, из которой они диффундируют в сосуды микроциркуляторного русла и лимфатические сосуды. Период выведения различных препаратов из кожного «депо» колеблется от 3 ч до 15-20 суток. Это обусловливает продолжительное пребывание лекарственных веществ в организме и их пролонгированное лечебное действие. Количество лекарственного вещества, проникающего в организм путем электрофореза, составляет 5-10 % от используемого лекарства при проведении лечебной процедуры. Повышение концентрации растворов (свыше 5%) для увеличения количества вводимых в организм веществ не улучшает леченый эффект. В этом случае возникают электрофоретические и релаксационные силы торможения, вследствие электростатического взаимодействия ионов (феномен Дебая-Хюккеля). Они тормозят перемещение ионов лекарств в ткани.

Фармакологические эффекты поступающих в организм лекарственных веществ проявляются при введении сильнодействующих препаратов и ионов металлов в малом количестве. Лекарственные средства действуют локально на ткани, находящиеся под электродами. Они способны вызывать выраженные рефлекторные реакции соответствующих органов, усиливать их кровоток и стимулировать регенерацию тканей. Например, ионы йода введенные в организм с помощью электрофореза увеличивают дисперсность соединительной ткани и повышают степень гидрофильности белков:

Ионы лития растворяют литиевые соли мочевой кислоты.

Ионы меди и кобальта активируют метаболизм половых гормонов и участвуют в их синтезе.

Ионы магния и кальция оказывают выраженное гипотензивное действие.

Ионы цинка стимулируют регенерацию и обладают фунгицидным действием.

Некоторые из введенных веществ могут изменять функциональные свойства кожных волокон тактильной и болевой чувствительности. Исходя из этого, совместное воздействие электрического тока и местных анестетиков вызывает уменьшение импульсного потока из болевого очага и создает анальгетический эффект постоянного тока. Такие явления выражены под катодом. Постоянный электрический ток изменяет фармакологическую кинетику и фармакологическую динамику вводимых препаратов. В результате сочетанного действия лечебные эффекты большинства из них (за исключением некоторых антикоагулянтов, ферментных и антигистаминных препаратов) потенцируются. Поступающие в кожу вещества накапливаются локально. Это позволяет создавать значительные концентрации этих веществ в поверхностных зонах поражения. При таком способе введения отсутствуют побочные эффекты перорального и парентерального введения лекарственных веществ. Действие балластных ингредиентов слабо выражено и растворы не требуют стерилизации. Это позволяет использовать их в полевых условиях. Возможно также накопление лекарственных веществ (в частности, антибиотиков) в патологических очагах внутренних органов (внутриорганный электрофорез), цитостатиков и иммуностимуляторов в опухолях (электрохимиотерапия). При этом концентрация лекарств в межэлектродных тканях увеличивается в 1,5 раза.

Суммарное количество прошедшего электричества через ткани не должно превышать 200 кулон. Количество применяемого лекарственного вещества обычно не превышает его разовой дозы для парентерального и перорального введения.

Гальванизация

Лечебный метод, при котором используется действие на организм постоянного тока незначительной силы, называется гальванизацией. Это связано со старым названием постоянного тока – гальванический ток. Первичное действие тока на ткани организма связано с движением в тканях ионов электролитов и других заряженных частиц. Разделение ионов и соответственно, изменение концентрации ионов в различных элементах тканевых структур происходит вследствие разной подвижности ионов, а так же задержки и накопления их у полупроницаемых мембран, в тканевых элементах, снаружи и внутри клеток. Это вызывает изменение функционального состояния клетки и другие физиологические процессы в тканях. Терапевтическое действие постоянного тока зависит от этого явления. Таким образом, изменение концентрации ионов в тканевых образованиях это основа первичного действия постоянного тока на организм человека.

Вследствие разной подвижности, а так же наличия на полупроницаемых мембранах оболочек, происходит разделение ионов и соответственно, изменение концентрации в различных элементах тканевых структур. Согласно ионной теории раздражения П.П. Лазарева, разрушение определенного соотношения концентрации ионов, находящихся по обе стороны оболочки вызывает в клетке состояние возбуждения, что является реакцией на действие электрического тока. Основное значение при этом имеет отношение концентрации одновалентных ионов Na и К к концентрации двухвалентных ионов Ca и Mg .

Повышение этого соотношения вызывает реакцию возбуждения, а понижение-реакцию торможения. В частности действие в области катода при замыкании тока связано с повышением концентрации более подвижных одновалентных ионов, преимущественно К и Na, а повышение возбудимости в области анода связано с концентрацией менее подвижных, и поэтому остающихся в избытке вблизи анода, двухвалентных ионов Са, Mg и др.

При гальванизации постоянный ток напряжением 60-80 В, силой тока от 5 до 15 мА, при плотности тока, не превышающей 0,1 mА/см 2 , подводится к тканям с помощью электродов. Наложение металлических электродов непосредственно на кожу недопустимо. Потому что, образующиеся на поверхности электродов продукты электролиза раствора хлористого натрия, содержащегося в тканях, раствор поваренной соли, находящийся в составе пота, обладают прижигающим свойством и вызывают ожоги кожи. Для этого используется достаточно толстая прокладка (1) (см. рис. 1) из гигроскопического материала (из байки, фланели или токопроводящего губчатого материала) толщиной не менее 1 см, размеры которой на 1,5 – 2 см превышают размеры металлической пластинки по всему периметру. Прокладка смачивается водой или слабым солевым раствором. Она впитывает в себя продукты вторичных реакций на электроде. Эта прокладка укладывается на поверхность кожи под электрод (2). Прокладка с электродом укрепляются и плотно прижимаются к телу в нужном месте при помощи жгутов или эластических бинтов (3). Прокладки стерилизуются кипячением и используются повторно.

Для подведения постоянного тока к подлежащему воздействию участку тела больного используют электроды соответствующих форм и размеров. Электрод состоит из металлической пластинки или из иного хорошо проводящего ток материала. В качестве материала для электродов применяется свинец луженый оловом. С одной стороны он обладает мягкостью, с другой – он образует самый малоподвижный ион. Потому ионы свинца не участвуют в образовании тока.

Для соединения электродов с клеммами аппарата применяют многожильные изолированные провода.

При подготовке к проведению лечебной процедуры гальванизации гидрофильные прокладки погружают в горячую водопроводную воду, затем их умеренно отжимают и накладывают на подлежащие воздействию участки тела вместе с токопроводящими пластинками, соединенными с многожильными проводами. Провода соединяют с пластинами специальными пружинящими зажимами, припаивают или накладывают на пластину. Все вместе плотно прибинтовывают эластичным бинтом, прижимают мешочки с песком. Плотное и ровное прилегание прокладок к телу и невозможность соприкосновения с ним металлической части электрода должны быть тщательно проверены, равно как проверено и отсутствие на коже под электродами ссадин, царапин и других нарушений эпидермального слоя (в крайнем случае, мелкий дефект кожи может быть прикрыт кусочком ваты или марли с вазелином).

Электропроводимость отдельных участков организма, находящихся между электродами, наложенными непосредственно на поверхность тела, существенно зависит от сопротивления кожи и подкожных слоев. Внутри организма ток распространяется в основном по кровеносным и лимфатическим сосудам, мышцам, оболочкам нервных стволов. Сопротивление кожи, в свою очередь, определяется ее состоянием: толщиной, возрастом, влажностью и т.п. Применяют поперечное, продольное или косое расположение электродов на теле пациента. Расстояние между обращенными друг к другу краями обоих электродов должно быть не меньше ширины одного из электродов. Обычно применяют равновеликие электроды. Однако в отдельных случаях, при необходимости усилить действие тока на том или ином участке тела, на нем располагают электрод меньшей площади по сравнению со вторым. При необходимости воздействия на область мелких суставов пальцев кистей и стоп пользуются плоскими ванночками (одно- или двухкамерная ванна). Металлический электрод при этом опускают в воду ванночки по возможности дальше от погружаемого участка тела таким образом, чтобы исключить случайные соприкосновение тела с металлической частью электрода; второй электрод помещают проксимально — на руке или ноге больного, в шейно — лопаточной или поясничной области позвоночника.

Для процедур гальванизации используется аппарат «Поток – 1». Аппарат гальванизации это регулируемый источник постоянного тока, питаемый от сети. Аппарат имеет корпус из ударопрочного полистирола, состоящий из собственного корпуса и съемного дна.

Миллиамперметр (1), расположен слева на верхней стенке корпуса, служащей панелью управления. Ручка регулятора тока «3», — справа от амперметра — переключатель диапазонов тока и пределов измерения миллиамперметра «5mA–50mA» «4», контрольная лампочка «2», сетевой выключатель «Вкл-Выкл» (5), выходные гнезда (6) (« +» – красная клавиша, «-» — черная клавиша).

До проведения процедур необходимо проверить правильность установки переключателя напряжения сети. Перевести выключатель сети в положение «Выкл», переключатель диапазонов — в положение «5 mA», а ручку регулировки тока — в нулевое положение. Включить вилку сетевого шнура в розетку питающей сети. Подключить соединительные провода к выходным зажимам и укрепить в их зажимах выбранные электроды. Наложить на тело больного электроды с прокладками, смоченными водой или лекарственным раствором (при проведении процедур лекарственного электрофореза). Включить сетевое напряжение (при этом загорится лампа на панели управления) и, плавно поворачивая ручку регулятора, установить необходимое значение тока. Следует иметь в виду, что в течение первых минут после начала процедуры сопротивление тела несколько уменьшается, что приводит к увеличению тока. По этой причине в начале процедуры необходимо следить за величиной тока и при необходимости подрегулировать его. Для уменьшения диапазона тока предварительно вывести в начальное положение ручку регулировки тока и снять электроды с пациента. При перерыве в работе выключить сетевое питание, переведя ручку сетевого выключателя в положение «выкл».

Включения тока должно начинаться с нулевого значения, нарастать очень постепенно и плавно, без рывков и толчков. Выключение должно проводиться также очень плавно до нуля. По окончании процедуры аппарат должен быть выключен и провода отключены от него.

Процедура общей гальванизации проводится с использованием ванн, наполненных водой, в которые погружаются конечности больного. Если необходимо повысить концентрацию тех или иных ионов во всем организме, то с этой целью применяется четырехкамерная ванна.

Подводимый к больному ток дозируется по плотности – отношению силы тока к площади электрода. Допустимая плотность тока при местной гальванизации не должна превышать 0.1 mA/сm 2 . При общих воздействиях допустимая плотность тока на порядок ниже — 0.01 mA/сm 2 — 0.05 mA/сm 2 . Помимо объективных показателей, при дозировании учитывают и субъективные ощущения больного. Во время процедуры он должен чувствовать легкое покалывание (пощипывание) под электродами во время процедуры. Появление чувства жжения служит сигналом к снижению плотности проводимого тока.Длительность процедур, частота проведения и общее число их на курс лечения зависит от характера, стадии и фазы заболевания, общего состояния больного и его индивидуальных особенностей.

Продолжительность гальванизации не превышает 20 – 30 мин. Обычно на курс лечения назначаются 10 – 15 процедур. При необходимости повторный курс гальванизации проводится через один месяц.

Гальванизацию сочетают с высокочастотной магнитотерапией (гальваноиндуктотермия), пелоидотерапией (гальванопелоидотерапия) и акупунктурой (гальваноакупунктура).

К преимуществам метода лекарственного электрофореза относят:
1. создание кожного депо, в котором лекарственные вещества обнаруживаются от 1 до 3 дней,
2. воздействие непосредственно на патологический очаг,
3. значительное урежение физиологических реакций,
4. безболезненное введение лекарственных веществ.
ГАЛЬВАНИЗАЦИЯ ПОКАЗАНА при лечении
— травмы и заболевания периферической нервной системы-ПНС (плекситы, радикулиты, моно- и полинейропатии, невралгии и др.),
— травмы и заболевания ЦНС ( черепно-мозговые и спиномозговые травмы, расстройства мозгового и спинального кровообращения),
— вегетативная дистония, неврастении и другие невротические состояния,
— заболевания органов пищеварения, протекающие с нарушением моторной и секреторной функции (хронические гастриты, колиты, холециститы, дискинезии желчевыводящих путей, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки),
— гипертоническая и гипотоническая болезнь, стенокардия, атеросклероз в начальных стадиях,
— хронические воспалительные процессы в различных органах и тканях,
— хронические артриты и периартриты травматического, ревматического и обменного происхождения.
ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ для гальванизации:
новообразования, острые воспалительные и гнойные процессы, системные заболевания крови, резко выраженный атеросклероз, гипертоническая болезнь III стадии, лихорадочное состояние, экзема, дерматит, обширные нарушения целостности кожного покрова и расстройства кожной чувствительности в местах наложения электродов, склонность к кровотечениям, беременность, индивидуальная непереносимость гальванического тока.
ПОКАЗАНИЯ К ЛЕКАРСТВЕННОМУ ЭЛЕКТРОФОРЕЗУ
весьма широки – они определяются фармакотерапевтическими свойствами вводимого препарата с обязательным учётом показаний к использованию постоянного тока. На общее действие лекарственного вещества можно рассчитывать главным образом при функциональных вегетативно-сосудистых расстройствах и состояниях, при которых достаточно микродозы лекарственных веществ.
Противопоказания к лекарственному электрофорезу те же, что и к гальванизации, а также индивидуальная непереносимость лекарственных веществ.

Одной из важнейших задач при разработке, промышленном выпуске и эксплуатации электромедицинской аппаратуры является обеспечение полной электробезопасности для обслуживающего персонала и пациентов. Основными предохранительными средствами от действия на организм электрического тока является защитное заземление, зануление. Поражение организма электрическим током может быть в виде электрической травмы или электрического удара .Электрическая травма – это результат внешнего местного действия тока на тело: электрические ожоги, электрометаллизация кожи, знаки тока. Электрические ожоги являются следствием теплового действия тока, проходящего через тело человека, либо происходят под действием электрической дуги, возникающей обычно при коротких замыканиях в установках с напряжением выше 1000 В. Электрометаллизация кожи происходит при внедрении в кожу мельчайших частиц расплавленного под действием тока металла. Электрические знаки тока, являющиеся поражением кожи в виде резко очерченных округлых пятен, возникают в местах входа и выхода тока из тела при плотном контакте с находящимися под напряжением частями тела человека. Электрический удар – возбуждение тканей организма под действием тока, которое сопровождается непроизвольным судорожным сокращением мышц. Электрические удары могут вызывать наиболее тяжелые повреждения, поражая внутренние органы человека: сердце, легкие, центральную нервную систему и др. расстройство сердечной деятельности (нарушение ритма, фибрилляция желудочков сердца), расстройство дыхания, шок, в особо тяжелых случаях приводящие к смертельному исходу может быть в результате электрического удара иметь. Действие электрического тока на организм зависит от большого количества различных факторов, основными из которых являются: величина тока, определяемая приложенным к телу напряжением и сопротивлением тела, вид и частота тока, продолжительность воздействия, путь прохождения тока.

Величина тока является основным параметром, определяющим степень поражения. ощущения тока частотой 50-60 Гц появляются при силе тока 1 мА при сжимании руками электродов, судороги в руках начинаются при увеличении тока до 5-10 мА, при токе 12-15 мА уже трудно оторваться от электродов. При 50-80 мА паралич дыхания наступает, а при 90-100 мА и длительности воздействия 3 секунды и более – паралич сердца. При действии постоянного тока соответствующие реакции могут быть в момент замыкания и размыкания цепи и наступают при его большой величине. Так ощущения постоянного тока появляются при 5-10 мА, затруднение дыхания при 50-80 мА, паралич дыхания – при 90-100 мА.

Электрическое сопротивление тела не является постоянной величиной. На низких частотах оно определяется, в основном, сопротивлением рогового слоя кожи. При неповрежденной сухой коже ее удельное объемное сопротивление составляет около 10 Ohm∙m. При влажной коже ее сопротивление может снижаться в десятки и сотни раз.

Сопротивление кожи является нелинейной величиной, оно зависит от величины и времени приложения напряжения, значительно уменьшаясь после пробоя ее верхнего слоя. Сопротивление кожи уменьшается также с нагревом и увеличением потоотделения, что имеет место при большой площади контакта и значительном контактном давлении. Сопротивление внутренних органов практически не зависит от вышеуказанных факторов и принимается равным 1000 Ом.

время действия тока на организм имеет важнейшее значение для исключения несчастного случая. сила тока увеличивается с уменьшением времени действия, не вызывающая паралича, или фибрилляции сердца.

путь тока в теле человека является важным. случаи поражения, при которых ток проходит через сердце и легкие, т.е. от руки к руке, или от руки к ноге особенно опасны.

случаи поражения электрическим током связаны с касанием металлических частей, находящихся под напряжением питающей сети наиболее часто встречаются. Это могут быть сетевые провода, металлические корпуса изделий, имеющих поврежденную изоляцию и замыкание сети на корпус. Напряжение прикосновения снижается примерно во столько раз, во сколько сопротивление заземления меньше сопротивления тела человека. Сопротивление защитного заземления, применяемого при эксплуатации электромедицинской аппаратуры, не должно быть более 4 Ом. Электромедицинские приборы и аппараты имеют рабочую часть, соединенную с током или касающуюся тела пациента (электроды, излучатели, датчики). электрическая энергия передается тканям тела пациента с помощью рабочей части при применении терапевтических, хирургических электромедицинских аппаратов. биопотенциалы воспринимаются с помощью рабочей части при использовании диагностических электромедицинских приборов. Наличие рабочей части приводит связи пациента с аппаратурой и к повышенной опасности поражения электрическим током. электрический ток используется для лечебного воздействия на организм в некоторых лечебных аппаратах. Неправильная эксплуатация таких аппаратов связана с возможностью передозировок.

Пациент во многих случаях не может реагировать на действие электрического токаю Он может быть парализован, находиться под наркозом. Кожный покров пациента обрабатывается дезинфицирующими и другими растворами и теряет свои защитные свойства. Условия проведения диагностических и лечебных процедур могут быть самыми различными, от кабинета лечебного учреждения, до жилых помещений. Различные условия эксплуатации, накладывают дополнительные требования к электробезопасности аппаратуры.

Основные требования к электробезопасности электромедицинских приборов и аппаратов.

Одно из основных требований электробезопасности — исключить возможность случайного прикосновения к находящимся под напряжением частям. Части, находящиеся под напряжением, не должны становиться доступными после снятия, крышек, задвижек, а также сменных частей. различные способы применяют для защиты от напряжения. Защитное заземление осуществляется с помощью заземляющего устройства, состоящего из заземлителей и заземляющих проводников.

Заземлители подразделяются на естественные и искусственные. металлические конструкции и аппаратура железобетонных конструкций зданий могут быть использованы в качестве естественных заземлителей. Если естественные зеземлители отсутствую, или если их сопротивление превышают 4 Ом, то необходимо устройство искусственных заземлителей. выходная мощность должна быть минимальной. Для исключения электрических травм при использовании приборов с широкими пределами регулирования выходной мощности

В аппаратах для электрохирургии весьма важно правильное наложение пассивного электрода на пациента и надежное соединение его с аппаратом. Как следует из примеров, использование средств автоматики позволяет значительно снизить опасность для пациента, которая может быть вызвана как нарушениями в аппарате, так и небрежным или неправильным действием обслуживающего медперсонала.

Лабораторная работа (лабораторные исследования, выполнение практической работы, овладение и закрепление практических навыков ).

Упражнение 1. Проверка исправности аппарата «Поток-1».

Переключатель сети Т₁ поставить в положение «выкл», а Т₃ в положение «50».
Ручку потенциометра R повернуть до отказа против часовой стрелки.
Подключить к выходным клеммам аппарата (6) сопротивление порядка 10 000 Ом.
Переключатель сети Т₁ поставить в положение «Вкл». Сигнальная лампа ЛП (2) должна загореться.
Подождите 2-3 мин., для нагрева аппарата.
Плавно вращая по часовой стрелки рукоятку потенциометра, проследите за изменением тока. Плавное изменение тока свидетельствует об исправности аппарата.
Поверните до отказа против часовой стрелки ручку потенциометра.
Отключите прибор переводом тумблера Т₁ в положение «выкл».
Запишите в отчет заключение о состоянии аппарата.

Упражнение 2. Проверка полюсов.

Отсоедините сопротивление.
Присоедините к каждой клемме по медному электроду.
Положите в чашку вату и смочите ее немного раствором K I.
Положите электроды от аппарата на чашку Петри так, чтобы расстояние между электродами было 2 см, и хороший контакт с ватой.
Включите прибор переводом тумблер Т₁ в положение «вкл».
Установите ток порядка 5-20 мА, поворачивая ручку потенциометра.
Пронаблюдайте изменение, происходящее у электродов, пока у одного из них не появится интенсивное окрашивание ваты.
Ручку поверните против часовой стрелки до отказа.
Отключите прибор тумблером Т₁ в положение «выкл».
Опишите реакции, происходящие у электродов, и установите правильность обозначения клемм прибора.

Упражнение 3. Определение ощутимого тока, протекающего через ткань организма.

Дата добавления: 2016-10-30 ; просмотров: 883 | Нарушение авторских прав

источник