Электрофорез белков в полиакриламидном геле
Электрофорез белков в агарозном геле
Электрофорез (от электро- и греч. переносить) — это электрокинетическое явление перемещения частиц дисперсной фазы (коллоидных или белковых растворов) в жидкой или газообразной среде под действием внешнего электрического поля. Впервые было открыто профессорами Московского университета П. И. Страховым и Ф. Ф. Рейссом в 1809 году.
С помощью электрофореза удаётся покрывать мелкими частицами поверхность, обеспечивая глубокое проникновение в углубления и поры. Различают две разновидности электрофореза: катафорез — когда обрабатываемая поверхность имеет отрицательный электрический заряд (то есть подключена к отрицательному контакту источника тока) и анафорез — когда заряд поверхности положительный.
Электрофорез применяют в физиотерапии, для окраски автомобилей, в химической промышленности, для осаждения дымов и туманов, для изучения состава растворов и др. Электрофорез является одним из наиболее важных методов для разделения и анализа компонентов веществ в химии, биохимии и молекулярной биологии.
Лечебное вещество наносится на прокладки электродов и под действием электрического поля проникает в организм через кожные покровы (в терапии, неврологии, травматологии и др.) или слизистые оболочки (в стоматологии, ЛОР, гинекологии и др.) и влияет на физиологические и патологические процессы непосредственно в месте введения. Электрический ток также оказывает нервно-рефлекторное и гуморальное действие.
Преимущества лечебного электрофореза:
— введение малых, но достаточно эффективных доз действующего вещества;
— накопление вещества и создание депо, пролонгированность действия;
— введение в наиболее химически активной форме — в виде ионов;
— возможность создания высокой местной концентрации действующего вещества без насыщения им лимфы, крови и других сред организма;
— возможность введения вещества непосредственно в очаги воспаления, блокированные в результате нарушения локальной микроциркуляции;
— лечебное вещество не разрушается, как например, при введении per os;
— слабый электрический ток благоприятно влияет на реактивность и иммунобиологический статус тканей.
Противопоказания к проведению электрофореза: острые гнойные воспалительные заболевания, лихорадка, тяжелая форма бронхиальной астмы, дерматит или нарушение целостности кожи в местах наложения электродов, злокачественные новообразования. Учитываются противопоказания для лечебного вещества. Вещества, используемые при электрофорезе, по способу введения разделяются на:
— отрицательно заряженные, вводимые с отрицательного полюса — катода (бромиды, йодиды, никотиновая кислота и другие);
— положительно заряженные, вводимые с положительного полюса — анода (ионы металлов — магний, калия, кальция);
— вводимые как с анода, так и с катода.
Преимущество бишофита — в биполярном введении, так как эффект оказывают одновременно и положительно, и отрицательно заряженные ионы.
Электрофорез в научных исследованиях
В биохимии и молекулярной биологии электрофорез используется для разделения макромолекул — белков и нуклеиновых кислот. Различают множество разновидностей этого метода. Этот метод находит широчайшее применение для разделения смесей биомолекул на фракции или индивидуальные вещества и используется в биохимии, молекулярной биологии, клинической диагностике, популяционной биологии (для изучения генетической изменчивости) и др.
Изотахофорез (ИТФ) — метод разделения различных типов ионов по их подвижности в электрическом поле. При ИТФ все виды ионов мигрируют в одном направлении, образуя набор зон, находящихся в равновесном состоянии и перемещающимися с одинаковыми скоростями.
В основе метода ИТФ лежит система, состоящая из трех различных электролитов, объединенных общим противоионом:
— ведущий электролит, содержащий анионы с наиболее высокой электрофоретической подвижностью, располагается в анодной области;
— замыкающий электролит, содержащий анионы с минимальной подвижностью, располагается в катодной области;
— смесь электролитов анализируемой смеси, содержащая анионы с промежуточной подвижностью.
Если через эту систему пропустить электрический ток, то анионы расположатся последовательно в соответствии с их электрофоретической подвижностью, ведущий в области анода, замыкающий в области катода, остальные между ними в виде узких зон с четкими концентрационными границами. Ширина отдельных зон по завершении процесса соответствует абсолютному количеству в смеси того или иного аниона.
Поскольку отдельные зоны располагаются последовательно. они практически соприкасаются, поэтому в исследуемый образец вносят буфер, содержащий анион с промежуточной подвижностью, зона которого встроится в полученную последовательность и раздвинет зоны исследуемых анионов. Эти вспомогательные зоны называются спейсерами — разделителями, функции которых выполняют амфолиты-носители, используемые в методе ИЭФ. особенностью метода ИТФ является то, что процесс сопровождается концентрированием зон, эффект от которого приводит к разрешению, сравнимому и даже превосходящему разделение методом ИЭФ. Результаты разделения смесей методом ИТФ фиксируются на ленте самописца в виде графика измерения трех параметров:
— интегральная кривая тепловыделения: по этой кривой можно определить разницу температур между соседними зонами, что служит мерой градиента напряженности поля, то есть разницы электрофоретических подвижностью двух ионов
— дифференциальная кривая тепловыделения: длина отрезков этой кривой соответствуют ширине зоны вещества, а также служит мерой абсолютного количества вещества в пробе
— кривая поглощения в УФ-свете: длина отрезков этой кривой соответствует значению экстинкции вещества. Зная коэффициент молярной экстинкции вещества, можно определить абсолютное содержание вещества в пробе, а также вычислить его концентрацию в зоне.
Аналитический изотахофорез проводят в капиллярном приборе для изотахофореза, в тефлоновом капилляре с внутренним диаметром 0,5 мм.
Препаративный изотахофорез проводят в колонке с полиакриламидным гелем.
· Аналитическое разделение (мкг) пептидов, белков, нуклеотидов, органических кислот, ионов металлов (частично изотопов) с высоким разрешением.
· Препаративное разделение белков (г).
· Накопление в виде узкой зоны следовых количеств веществ (мкг) из больших объемов пробы вследствие эффекта концентрирования.
· Определение электрофоретической подвижности.
электрофорез молекулярный биология капиллярный
Капиллярный электрофорез, известный также как капиллярный зональный электрофорез, используется для разделения ионов по заряду. В случае обычного электрофореза заряженные молекулы перемещаются в проводящей жидкости под действием электрического поля. В 1960х годах была предложена методика капиллярного электрофореза для разделения молекул по заряду и размеру в тонком капилляре, заполненном электролитом.
Для проведения капиллярного электрофореза требуется относительно простое оборудование.
Основные компоненты системы — флакон для нанесения образца, стартовый флакон, конечный флакон, капилляр, электроды, мощный источник питания, детектор и устройство обработки данных. Флакон для нанесения образца, стартовый и конечный флаконы заполнены электролитом, например, водным буферным раствором. Для нанесения образца конец капилляра опускают в флакон с образцом и затем перемещают в стартовый флакон. Перемещение анализируемых веществ осуществляется под действием электрического поля, которые прилагают между стартовым и конечным флаконами. Все ионы передвигаются по капилляру в одном направлении под действием электроосмотического тока. Анализируемые вещества разделяются по электрофоретической мобильности и детектируются около конца капилляра.
Детектирование разделившихся молекул при капиллярном электрофорезе может осуществляться различными устройствами. Наиболее распространенные приборы детектируют изменение поглощения излучения в ультрафиолетовой области или в области видимого света. Обычно в таких системах в качестве ячейки используют участок капилляра. Длина пути проходящего света при капиллярном электрофорезе составляет порядка 50 микрометров, что намного меньше, чем в случае обычных ультрафиолетовых ячеек, в которых длина пути света порядка 1 сантиметра.
В соответствии с законом Бугера -Ламберта-Бера, чувствительность детектора пропорциональна длине пути, по которому свет проходит через ячейку. Для увеличения чувствительности удлиняют путь, по которому проходит свет, однако при увеличении размеров ячейки снижается разрешение. Капиллярная трубка может быть расширена в месте детектирования, такую разновидность называют пузырьковой ячейкой. В другом варианте увеличение пути проходящего света достигается за счёт добавления дополнительного капилляра. Оба этих метода снижают эффективность разделения.
Для того, чтобы отличить сходные образцы, системы разделения капиллярным электрофорезом могут быть напрямую связаны с масс-спектрометрами. В большинстве таких систем конец капилляра помещают в прибор для электроаэрозольной ионизации. Ионизированные частицы далее анализируют масс-спектрометрией.
Электрофорез белков — способ разделения смеси белков на фракции или индивидуальные белки. Электрофорез белков применяют как для анализа компонентов смеси белков, так и для получения гомогенного белка. Наиболее распространенным вариантом электрофоретического анализа белков, является электрофорез белков в полиакриламидном геле.
Существует множество разновидностей и модификаций данного метода, которые используются в различных областях:
· Электрофорез в свободных средах (без поддерживающей среды)
· Электрофорез с подвижной границей
· Зональный электрофорез в поддерживающей среде с капиллярной структурой
· Электрофорез на фильтровальной бумаге
· Электрофорез белков на ацетат-целлюлозной мембране
· Электрофорез в колонках и блоках гранулированной поддерживающей среды
· Электрофорез белков в ПААГ
· Электрофроез белков в крахмальном геле
· Электрофорез белков в агарозном геле
Электрофорез белков подразделяется также на одномерный и двумерный (2D-) электрофорез, препаративный и аналитический, а также электрофорез нативных белков и электрофорез в присутствии детергента. Разновидностью метода электрофореза являются изоэлектрическое фокусирование и изотахофорез. В случае использования иммунологических методов для выявления разделённых белков говорят про иммуноэлектрофорез.
Электрофорез белков в полиакриламидном геле
Электрофорез белков в полиакриламидном геле — метод разделения смесей белков в полиакриламидном геле в соответствии с их электрофоретической подвижностью (функцией длины полипептидной цепочки или молекулярной массы, а также укладки белковой молекулы, посттрансляционных модификаций и других факторов). Данный способ фракционирования белков и пептидов широко применяют в современной молекулярной биологии, биохимии, генетике.
Разработано большое количество модификаций электрофореза белков в полиакриламидном геле для решения разных задач и для различных белков и пептидов. Наиболее распространённой разновидностью является электрофорез белков в полиакриламидом геле в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли.
В 1970 году Лэммли для изучения процесса сборки капсида бактериофага Т4 предложил метод электрофоретического разделения белков в полиакриламидном геле в зависимости от молекулярной массы. Для этого перед нанесением на гель образцы кипятили в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) и 2-меркаптоэтанола. Под воздействием 2-меркаптоэтанола происходит восстановление дисульфидных связей, что предотвращает выпетливание денатурированных полипептидов и повышение их подвижности. SDS является сильным детергентом, его молекула состоит из двенадцатичленной алифатической неразветвленной цепи и ковалентно связанного с ним сульфата, имеющего в растворе отрицательный заряд.
При использовании описываемого метода исходят из следующих допущений:
— белки после обработки SDS находятся в полностью денатурированном состоянии;
— количество молекул SDS, связанных с полипептидом, пропорционально его длине, и, следовательно, молекулярной массе;
— собственный заряд полипептида несущественен в сравнении с зарядом связанного с ним SDS.
В данных условиях, все полипептиды имеют одинаковый удельный заряд и разделяются обратно пропорционально логарифму их молекулярной массы. Практика подтверждает верность данных предположений в подавляющем большинстве случаев.
Для проведения денатурирующего электрофореза в ПААГ используются различные буферные системы. Наиболее распространённая система, которая подразумевается по умолчанию — это буферная система Лэммли. Кроме того, в подавляющем числе работ используют, так называемый, disc-электрофорез то есть используют гель, состоящий из двух частей. Концентрирующий гель имеет pH 6,8 и концентрацию полиакриламида от 2 до 8 %. Разделяющий гель имеет рН в районе 8,5-9 и концентрацию полиакриламида от 5 до 20 %. Выбор плотности геля зависит от молекулярных масс исследуемых белков. Все буферы не содержат неорганических солей, основным переносчиком тока в них является глицин. При рН 6,8 суммарный заряд молекулы глицина близок к нулю. Вследствие этого для переноса определенного заряда (который определяется силой тока в электрофоретической ячейке), отрицательно заряженные комплексы полипептидов с SDS должны двигаться с большой скоростью. При рН 8,8 глицин приобретает отрицательный заряд, вследствие чего на границе концентрирующего и разделяющего гелей белки резко тормозятся (в переносе одинакового заряда через единицу площади теперь участвует гораздо больше заряженных молекул, следовательно, они двигаются с меньшей скоростью). Результатом этого является концентрирование белков на границе гелей, что очень сильно повышает разрешающую способность метода.
В разделяющем геле белки мигрируют в зависимости от длины полипептидной цепи, то есть обратно пропорционально молекулярной массе.
Электрофоретическая подвижность биополимеров в геле зависит от ряда параметров. Скорость миграции пропорциональна заряду молекулы, и в свободной жидкости молекулы с одинаковым удельным зарядом мигрируют с равной скоростью. В случае разделения в среде, имеющей жесткую пространственную матрицу, происходит сегрегация за счет трения о гель. Сила трения зависит от пространственной конфигурации молекулы, в том числе от её размера. Таким образом, в случае электрофоретического разделения нативных белков будет наблюдаться сложная картина их распределения в зависимости от вышеприведенных факторов.
Визуализация продуктов разделения
Для визуализации результатов электрофореза чаще всего используют окрашивание белков в гелях красителем Кумасси или серебром. Для проведения вестерн блоттинга белки переносят из геля на нитроцеллюлозную мембрану.
В большинстве случаев результаты электрофоретического разделения достаточно получить путем визуальной оценки геля. Однако, с целью получения достоверных данных и надлежащего документирования результатов, гель сканируют на просвет при помощи высокочувствительного денситометра. По сути, денситометр является сканером, который относится к контрольно-измерительным приборам и подлежит поверке с целью определения и подтверждения соответствия характеристик средства измерения установленным требованиям. Подобные требования к денситометру позволяют надежно определять не только положение белков в геле, но и оптическую плотность белкового пятна. Оцифрованное изображение геля обрабатывают при помощи специализированного программного обеспечения, которое позволяет достоверно определить такие параметры как электрофоретическая подвижность белка, его чистота, количество белка в пятне и др. Определение молекулярной массы исследуемого белка предполагает необходимость калибровки геля по молекулярным массам. Калибруют гель относительно молекулярных масс белков-маркеров, которые разделяют параллельно с исследуемым образцом. Смеси маркерных белков доступны в различном интервале масс. Калибрование предполагает построения зависимости относительной электрофоретической подвижности (Rf) каждого из маркерных белков от десятичного логарифма их молекулярной массы. Обычно зависимость имеет вид сигмообразной кривой. Расчет молекулярной массы исследуемого белка осуществляют относительно его Rf, используя при этом метод регрессионного анализа. Достоверными результаты считаются, в случае если длина пробега белков-маркеров составляет не менее 80% длины разделяющего геля, а зависимость их Rf от логарифма молекулярной массы является линейной (R2 > 0,95). Т.е. для расчетов используют лишь тот участок калибровочной кривой, который покрывает электрофоретическую подвижность исследуемого белка.
Чувствительность метода SDS-PAGE по Лэммли обратно пропорциональна молекулярной массе белка. Например, в интервале 10-20 кДа удается разделить белки, отличающиеся всего на 0,1 кДа (разница всего в один аминокислотный остаток). Однако, для получения удовлетворительных результатов следует выполнить несколько простых методических рекомендаций. Так, в связи с тем, что высокая электропроводность исследуемых образцов способна значительно исказить электрофоретическую подвижность белка, их ионная сила должна быть по возможности минимальной и приблизительно равной. Еще одним важным условием надежности определения молекулярной массы является оптимальная нагрузка белка на гель. При окраске Coomassie Blue R250 оптимальное содержание белка в пятне должно находиться в пределах 0,1-1 мкг и как минимум на порядок меньше при окраске серебром. В противном случае белки в геле сформируют широкие пятна, что в свою очередь затруднит определение их электрофоретической подвижности. Несмотря на высокую чувствительность и несложность метода молекулярная масса белков, определенная с использованием SDS-PAGE, часто отличается от истинного значения. Разница может составлять от нескольких кДа для низкомолекулярных белков до десятков кДа для высокомолекулярных белков.
Для электрофореза белков в полиакриламидном геле в качестве буферных растворов используют: Трис-HCl, Трис-трицин, TBE, TBE с мочевиной, Bis-Tris.
Электрофорез в агарозном геле
Наиболее просты и удобны в использовании гели агарозы, которая представляет собой линейный полисахарид. Образование геля идёт путём связывания в пространственную сетку пучков нитей, за счёт образования водородных связей между ними. Благодаря механической прочности и достаточно большому размеру пор, агарозные гели нашли широкое применение при разделении крупных макромолекул, таких как ДНК. Варьируя концентрацию агарозы, можно менять средний размер пор в геле, и при концентрации агарозы в геле свыше 2% в нем становится возможным разделять не только НК, но и крупные белковые молекулы. Средний размер пор 2%-ного геля агарозы примерно соответствует размеру биополимера с массой 50 млн. дальтон. Использовать гели более высокой концентрации не целесообразно, т.к. при электрофорезе поры геля должны быть легко проницаемы для молекул биополимеров, чтобы лишь тормозить их миграцию в электрическом поле за счёт трения. Поэтому обычно применяются гели с концентрацией 0.4 — 2%, а наиболее распространены форезы в гелях с концентрацией около 1 %.
Агароза растворяется в воде при нагревании в кипящей водяной бане. Растворять агарозу непосредственно на нагревателе следует при интенсивном помешивании, однако делать этого не рекомендуется, во избежание пригорания агарозы к перегретому дну сосуда. В качестве альтернативного способа, может использоваться нагрев раствора в микроволновой печи, что занимает всего несколько минут. В этом случае, однако, необходимо внимательно следить за тем, чтобы раствор не закипел, иначе он моментально «убежит». Рекомендуется нагревать раствор на малой или средней мощности, перемешивая каждые полминуты. После застывания гель можно плавить повторно, однако делать это нужно только на водяной бане или при аккуратном нагреве в микроволновой печи. Некоторые авторы рекомендуют при первом приготовлении геля выдерживать расплавленную агарозу на водяной бане или в термостате не менее двух часов, для получения истинного раствора полимера.
Процесс плавления/застывания агарозы обладает ярко выраженным гистерезисом. Плавление разных типов агарозы обычно происходит при температурах 85-95°, тогда как застывание наступает при температурах 38-40°. Во избежание значительных тепловых деформаций расплавленную агарозу заливают в форму охлаждённой до 50-55°. При проведении количественного анализа расплавленный гель перед заливкой можно выдерживать в термостате при температуре 50- 55° в течение двух часов. Это рекомендуется делать для того, чтобы после заливки в форму, гель застывал равномерно по всему объёму. Застывший гель чистой агарозы не вполне прозрачный и на вид немного опалесцирует. Со временем он несколько уплотняется, вытесняя из себя жидкость, по этой причине агарозные гели перед использованием рекомендуется выдерживать в буфере в течение 12 и более часов.
Миграция ДНК в агарозном геле.
Гели агарозы содержат отрицательно заряженные группы, преимущественно сульфатные, полное количество которых зависит от степени очистки агарозы. Вследствие этого, при электрофорезе положительно заряженных молекул может возникать их неспецифическое взаимодействие с волокнами геля, которое проявляться в виде растягивания зон, при обратимом связывании с отрицательными группами геля, или в виде задержки, если взаимодействие необратимое. Кроме того, присутствие отрицательно заряженных групп приводит к возникновению электроосмоса, который вызывает противоток жидкости внутри геля, что однако затрудняет расчёт их электрофоретической подвижности. По некоторым данным, при использовании различных типов агарозы дня разделения трёх форм плазмидной ДНК (суперспиральной, релаксированной кольцевой и линейной) наблюдаются сильные изменения скорости миграции молекул, и что ещё важнее, изменяется взаимное расположение полос, соответствующих разным формам ДНК, в геле. Для количественного описания величины электроосмоса в агарозных гелях используют коэффициент относительной миграции который равен отношению скоростей миграции незаряженного полимера (только за счёт электроосмоса) и аналогичного по структуре полианиона при электрофорезе в агарозном геле данного тина. Обычно выделяют три типа агарозы: с низкой, средней и высокой степенью электроосмоса.
Помимо учёта эффектов электроосмоса, важно также правильно подобрать размеры пор геля и напряжённость электрического поля, в зависимости от свойств исследуемого образца. Дня оптимального разделения ДНК в агарозном геле необходимо создать условия, при которых молекулы ДНК могут достаточно свободно мигрировать в геле, лишь изредка сталкиваясь с его волокнами. В этом случае подвижность линейных молекул ДНК оказывается обратно пропорциональной логарифму их молекулярной массы, а, следовательно, и размеру.
Электрофорез ДНК — это аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру (длине) и форме (в случае, если ДНК образует вторичные структуры, например шпильки). Силы электрического поля, прикладываемого к образцам, заставляют фрагменты ДНК мигрировать через гель. Сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отрицательно и поэтому цепи ДНК двигаются от катода, заряженного отрицательно, к положительному аноду. Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее.
К образцам обычно добавляют низкомолекулярный кислый краситель (например, динитрофенол, бромфеноловый синий), чтобы визуализировать ход электрофореза в процессе. Краситель также необходим для того, чтобы определить, когда стоит остановить процесс.
Электрофорез проводится в камере, заполненной буферным раствором. Чаще всего используются буферы, содержащие ЭДТА, трис и борную кислоту. Буфер необходим для повышения ионной силы раствора, в котором будет происходить разделение молекул ДНК под действием приложенного электрического поля.
После разделения (иногда краситель вносят в расплавленную агарозу) фрагменты ДНК разной длины визуализируют при помощи флюоресцентных красителей, специфично взаимодействующих с ДНК, например, агарозные гели обычно красят бромистым этидием, который интеркалирует между азотистыми основаниями дуплекса и флюоресцирует в УФ-лучах.
Определение размеров производят путем сравнения коммерчески доступных фрагментов ДНК, содержащий линейные фрагменты ДНК известной длины.
Для электрофоретического анализа ДНК обычно используют агарозные (для относительно длинных молекул ДНК) и полиакриламидные (для высокого разрешения коротких молекул ДНК, например, в случае секвенирования) гели.
Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) — метод исследования антигенного состава биологических материалов, сочетающий электрофорез и иммунодиффузию. Впервые описан Грабаром и Уильямсом в 1953 году, в 1965 году метод был модифицирован Шейдеггером с целью минимизации.
Образец антигенного материала разделяют электрофорезом в геле (обычно агарозном), в результате чего формируются характерные зоны. Далее параллельно зонам электрофореза вносится преципитирующая антисыворотка, антигены и антисыворотка диффундируют навстречу друг к другу, и в месте встречи антисыворотки с антигеном появляются линии преципитации, имеющие форму дуги. После проведения иммунодиффузии и элюирования непреципитировавших молекул из геля гель окрашивают специальными красителями (например амидочёрным 10В, азокармином В и другими красителями, окрашивающими белки в случае белковых антигенов или суданом чёрным в случае липопротеиновых антигенов). Существует также ряд модификаций метода ИЭФ (при помощи чистого антигена, при помощи моноспецифической антисыворотки, метод ИЭФ по Оссерману, метод ИЭФ по Геремансу.
Наши специалисты проконсультируют или окажут репетиторские услуги по интересующей вас тематике.
Отправь заявку с указанием темы прямо сейчас, чтобы узнать о возможности получения консультации.
источник
Метод электрофореза в геле использует разницу в размере и заряде различных молекул в образце. Образец ДНК или белка, подлежащий разделению, погружают в пористый гель, помещенный в ионную буферную среду. При приложении электрического поля каждая молекула, имеющая разный размер и заряд, будет проходить через гель с разной скоростью.
Пористый гель, используемый в этой технике, действует как молекулярное сито, которое отделяет большие молекулы от более мелких. Меньшие молекулы движутся быстрее по гелю, а более крупные медленнее. Подвижность частиц также определется их индивидуальным электрическим зарядом. Два противоположно заряженных электрода, которые являются частью системы, тянут молекулы к себе на основе их заряда.
Гель, используемый в геле-электрофорезе, обычно изготавливают из материала, называемого агарозой, который представляет собой желатиновое вещество, экстрагированное из водорослей. Этот пористый гель можно использовать для отделения макромолекул разных размеров. Гель погружают в раствор солевого буфера в камеру электрофореза. Трис-борат-ЭДТА (ТВЭ) обычно используется в качестве буфера. Его основная функция — контролировать pH системы. Камера имеет два электрода — один положительный и другой отрицательный — на двух концах.
Образцы, которые необходимо проанализировать, затем загружают в маленькие лунки в геле с помощью пипетки. По завершении загрузки применяется электрический ток 50-150 В. Теперь заряженные молекулы, присутствующие в образце, начинают мигрировать через гель к электродам. Отрицательно заряженные молекулы движутся к положительному электроду, а положительно заряженные молекулы мигрируют к отрицательному электроду.
Скорость, с которой каждая молекула перемещается через гель, называется ее электрофоретической подвижностью и определяется главным образом ее чистым зарядом и размером. Сильно заряженные молекулы движутся быстрее, чем слабо заряженные. Меньшие молекулы работают быстрее, оставляя более крупные. Таким образом, сильный заряд и малый размер увеличивают электрофоретическую подвижность молекулы, а слабый заряд и большие размеры уменьшают подвижность молекулы. Когда все молекулы в образце имеют одинаковый размер, разделение будет основываться исключительно на их размере.
источник
Что такое клинические исследования и зачем они нужны? Это исследования, в которых принимают участие люди (добровольцы) и в ходе которых учёные выясняют, является ли новый препарат, способ лечения или медицинский прибор более эффективным и безопасным для здоровья человека, чем уже существующие.
Главная цель клинического исследования — найти лучший способ профилактики, диагностики и лечения того или иного заболевания. Проводить клинические исследования необходимо, чтобы развивать медицину, повышать качество жизни людей и чтобы новое лечение стало доступным для каждого человека.
У каждого исследования бывает четыре этапа (фазы):
I фаза — исследователи впервые тестируют препарат или метод лечения с участием небольшой группы людей (20—80 человек). Цель этого этапа — узнать, насколько препарат или способ лечения безопасен, и выявить побочные эффекты. На этом этапе могут участвуют как здоровые люди, так и люди с подходящим заболеванием. Чтобы приступить к I фазе клинического исследования, учёные несколько лет проводили сотни других тестов, в том числе на безопасность, с участием лабораторных животных, чей обмен веществ максимально приближен к человеческому;
II фаза — исследователи назначают препарат или метод лечения большей группе людей (100—300 человек), чтобы определить его эффективность и продолжать изучать безопасность. На этом этапе участвуют люди с подходящим заболеванием;
III фаза — исследователи предоставляют препарат или метод лечения значительным группам людей (1000—3000 человек), чтобы подтвердить его эффективность, сравнить с золотым стандартом (или плацебо) и собрать дополнительную информацию, которая позволит его безопасно использовать. Иногда на этом этапе выявляют другие, редко возникающие побочные эффекты. Здесь также участвуют люди с подходящим заболеванием. Если III фаза проходит успешно, препарат регистрируют в Минздраве и врачи получают возможность назначать его;
IV фаза — исследователи продолжают отслеживать информацию о безопасности, эффективности, побочных эффектах и оптимальном использовании препарата после того, как его зарегистрировали и он стал доступен всем пациентам.
Считается, что наиболее точные результаты дает метод исследования, когда ни врач, ни участник не знают, какой препарат — новый или существующий — принимает пациент. Такое исследование называют «двойным слепым». Так делают, чтобы врачи интуитивно не влияли на распределение пациентов. Если о препарате не знает только участник, исследование называется «простым слепым».
Чтобы провести клиническое исследование (особенно это касается «слепого» исследования), врачи могут использовать такой приём, как рандомизация — случайное распределение участников исследования по группам (новый препарат и существующий или плацебо). Такой метод необходим, что минимизировать субъективность при распределении пациентов. Поэтому обычно эту процедуру проводят с помощью специальной компьютерной программы.
- бесплатный доступ к новым методам лечения прежде, чем они начнут широко применяться;
- качественный уход, который, как правило, значительно превосходит тот, что доступен в рутинной практике;
- участие в развитии медицины и поиске новых эффективных методов лечения, что может оказаться полезным не только для вас, но и для других пациентов, среди которых могут оказаться члены семьи;
- иногда врачи продолжают наблюдать и оказывать помощь и после окончания исследования.
- новый препарат или метод лечения не всегда лучше, чем уже существующий;
- даже если новый препарат или метод лечения эффективен для других участников, он может не подойти лично вам;
- новый препарат или метод лечения может иметь неожиданные побочные эффекты.
Главные отличия клинических исследований от некоторых других научных методов: добровольность и безопасность. Люди самостоятельно (в отличие от кроликов) решают вопрос об участии. Каждый потенциальный участник узнаёт о процессе клинического исследования во всех подробностях из информационного листка — документа, который описывает задачи, методологию, процедуры и другие детали исследования. Более того, в любой момент можно отказаться от участия в исследовании, вне зависимости от причин.
Обычно участники клинических исследований защищены лучше, чем обычные пациенты. Побочные эффекты могут проявиться и во время исследования, и во время стандартного лечения. Но в первом случае человек получает дополнительную страховку и, как правило, более качественные процедуры, чем в обычной практике.
Клинические исследования — это далеко не первые тестирования нового препарата или метода лечения. Перед ними идёт этап серьёзных доклинических, лабораторных испытаний. Средства, которые успешно его прошли, то есть показали высокую эффективность и безопасность, идут дальше — на проверку к людям. Но и это не всё.
Сначала компания должна пройти этическую экспертизу и получить разрешение Минздрава РФ на проведение клинических исследований. Комитет по этике — куда входят независимые эксперты — проверяет, соответствует ли протокол исследования этическим нормам, выясняет, достаточно ли защищены участники исследования, оценивает квалификацию врачей, которые будут его проводить. Во время самого исследования состояние здоровья пациентов тщательно контролируют врачи, и если оно ухудшится, человек прекратит своё участие, и ему окажут медицинскую помощь. Несмотря на важность исследований для развития медицины и поиска эффективных средств для лечения заболеваний, для врачей и организаторов состояние и безопасность пациентов — самое важное.
Потому что проверить его эффективность и безопасность по-другому, увы, нельзя. Моделирование и исследования на животных не дают полную информацию: например, препарат может влиять на животное и человека по-разному. Все использующиеся научные методы, доклинические испытания и клинические исследования направлены на то, чтобы выявить самый эффективный и самый безопасный препарат или метод. И почти все лекарства, которыми люди пользуются, особенно в течение последних 20 лет, прошли точно такие же клинические исследования.
Если человек страдает серьёзным, например, онкологическим, заболеванием, он может попасть в группу плацебо только если на момент исследования нет других, уже доказавших свою эффективность препаратов или методов лечения. При этом нет уверенности в том, что новый препарат окажется лучше и безопаснее плацебо.
Согласно Хельсинской декларации, организаторы исследований должны предпринять максимум усилий, чтобы избежать использования плацебо. Несмотря на то что сравнение нового препарата с плацебо считается одним из самых действенных и самых быстрых способов доказать эффективность первого, учёные прибегают к плацебо только в двух случаях, когда: нет другого стандартного препарата или метода лечения с уже доказанной эффективностью; есть научно обоснованные причины применения плацебо. При этом здоровье человека в обеих ситуациях не должно подвергаться риску. И перед стартом клинического исследования каждого участника проинформируют об использовании плацебо.
Обычно оплачивают участие в I фазе исследований — и только здоровым людям. Очевидно, что они не заинтересованы в новом препарате с точки зрения улучшения своего здоровья, поэтому деньги становятся для них неплохой мотивацией. Участие во II и III фазах клинического исследования не оплачивают — так делают, чтобы в этом случае деньги как раз не были мотивацией, чтобы человек смог трезво оценить всю возможную пользу и риски, связанные с участием в клиническом исследовании. Но иногда организаторы клинических исследований покрывают расходы на дорогу.
Если вы решили принять участие в исследовании, обсудите это со своим лечащим врачом. Он может рассказать, как правильно выбрать исследование и на что обратить внимание, или даже подскажет конкретное исследование.
Клинические исследования, одобренные на проведение, можно найти в реестре Минздрава РФ и на международном информационном ресурсе www.clinicaltrials.gov.
Обращайте внимание на международные многоцентровые исследования — это исследования, в ходе которых препарат тестируют не только в России, но и в других странах. Они проводятся в соответствии с международными стандартами и единым для всех протоколом.
После того как вы нашли подходящее клиническое исследование и связались с его организатором, прочитайте информационный листок и не стесняйтесь задавать вопросы. Например, вы можете спросить, какая цель у исследования, кто является спонсором исследования, какие лекарства или приборы будут задействованы, являются ли какие-либо процедуры болезненными, какие есть возможные риски и побочные эффекты, как это испытание повлияет на вашу повседневную жизнь, как долго будет длиться исследование, кто будет следить за вашим состоянием. По ходу общения вы поймёте, сможете ли довериться этим людям.
Если остались вопросы — спрашивайте в комментариях.
источник
Электрофорез — направленное перемещение частиц дисперсной фазы под действием приложенной разности потенциалов. Это явление наблюдается в седиментационно устойчивых дисперсных системах. При наложении на такую систему внешней разности потенциалов происходит разрыв ДЭС по плоскости скольжения, в результате чего частица получает заряд и перемещается к соответствующему электроду.
Приведенные выше уравнения Гельмгольца — Смолуховского справедливы для электрофореза, в частности для электрокинетического потенциала используется уравнение (4.9). Отличие состоит только в системе координат: в одном случае рассматривается скорость жидкости, в другом — скорость движения частиц, которую обычно определяют по смещению цветной границы.
Электрофорез наблюдают в U-образном сосуде (см. лабораторный практикум). В нижнюю часть сосуда наливают золь, сверху — контактную (боковую) жидкость, имеющую одинаковую (или немного большую) с золем электрическую проводимость. Наблюдают за изменением уровня золя в обоих коленах трубки и по скорости перемещения частиц дисперсной фазы определяют линейную скорость электрофореза Wq :
где S — путь, пройденный золем за время г (время электрофореза).
При электрофорезе отношение линейной скорости к напряженности
электрического поля 
называют электрофоретической подвижностью:
Напряженность электрического поля Е зависит от приложенной разности потенциалов на электродах U и расстояния между ними L:
Рассмотренные уравнения справедливы при допущениях: 1) частицы движутся в однородном электрическом поле; 2) частицы могут иметь любую форму и не проводят электрический ток; 3) толщина ДЭС много меньше размеров частиц золя.
Для расчета ^-потенциала частиц, находящихся в разбавленных водных растворах при 293 К, можно использовать простое соотношение:
в котором электрофоретическая подвижность и, выражена в(тогда
^-потенциал будет иметь размерность В). 
Несовпадение экспериментальных и теоретических значений объясняется релаксационным эффектом и электрофоретическим торможением.
Релаксационный эффект проявляется в нарушении симметрии диффузионного слоя вокруг частицы при относительном перемещении фаз в противоположные стороны.
Электрофоретическое торможение обусловлено сопротивлением движению частицы обратным потоком противоионов, которые увлекают за собой жидкость. В некоторых случаях несовпадение можно учесть введением поправок, иногда этим несовпадением можно пренебречь.
Скорость электрофореза зависит нс только от приложенного напряжения, но и от радиуса частиц и других факторов. Это можно учесть введением в уравнение (4.8) поправочного коэффициента к:
Поправочный коэффициент определяется экспериментально в каждом отдельном случае электрофореза.
Для примера рассмотрим данные по электрофорезу в суспензиях глин Трошковского, Никольского и Слюдянского месторождений, микрофотографии которых приведены на рис. 1.1.
Электрокинетический потенциал определяли методом подвижной границы при электрофорезе и рассчитывали по уравнению:
где S — путь; 
L — расстояние между электродами;
U — разность потенциалов между электродами;
г — преимущественный радиус частицы, определяемый обычно по максимуму на кривой распределения частиц но размерам;
/(к г) — поправочная функция, учитывающая эффекты электрофоретического торможения и релаксации (табл. 4.1);
к — параметр Дебая, равный обратной величине плотной части двойного электрического слоя, то есть к = 1/6.
источник
Электрофорез занимает сейчас центральное место среди методов исследования белков и нуклеиновых кислот. В современной научной литературе редко можно встретить статью, в которой бы на той или иной стадии фракционирования или характеристики этих биополимеров не был использован электрофорез. Метод позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по таким важнейшим параметрам, как размеры (или молекулярная масса), пространственная конфигурация, вторичная структура и электрический заряд, причем эти параметры могут выступать как порознь, так и в совокупности.
Физический принцип метода заключается в следующем. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от рН среды. Если через этот раствор, заключенный в канал из изолирующего материала, например, стеклянную трубку, начать пропускать электрический ток, то вдоль канала установится определенный градиент напряжения, т. е. сформируется электрическое поле. Его напряженность измеряется разностью потенциалов по концам рабочего канала (или его участка), отнесенной к его длине (В/см). Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода, причем их трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают разные скорости, и в этом — сущность процесса электрофореза. Постепенно исходный препарат, состоявший из различных молекул, разделяется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с одной и той же скоростью. Со временем эти зоны распределяются по длине канала. В настоящее время почти исключительно используются полиакриламидные гели (ПААГ) и гели агарозы. Варьируя концентрацию полимера, можно получать гели с очень широким диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрические заряды макромолекул путем вариации рН буфера, а их конфигурацию путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов. Все это придает методу электрофореза исключительную гибкость.
В ходе электрофореза зоны растворенных макромолекул остаются невидимыми. Для наблюдения за процессом в исходный препарат добавляют краситель, молекулы которого несут электрический заряд того же знака, что и фракционируемые макромолекулы, но не взаимодействуют с ними. Краситель тоже передвигается в электрическом поле, но уже в виде окрашенной зоны. Его подбирают таким образом, чтобы скорость миграции наиболее подвижных макромолекул была несколько ниже, чем у молекул красителя. Когда окрашенная зона доходит до конца трубки, электрофорез прекращают.
Разделившиеся зоны биополимеров во избежание их диффузии немедленно фиксируют. Для этого гель извлекают из стеклянной формы и вымачивают в смеси кислоты со спиртом так, что белки или нуклеиновые кислоты выпадают в осадок в том самом месте, где закончилась их миграция в ходе электрофореза. После фиксации (или одновременно с ней) проводят окрашивание зон путем вымачивания геля в растворе красителя, прочно связывающегося с белком или нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют.
Вместо цилиндрических часто используют гели в виде тонких пластин, заполимеризованные между двумя плоскими стеклами. Такие пластины имеют важное преимущество: на них можно одновременно фракционировать несколько препаратов. Обычно их вносят с одного края геля на равных расстояниях друг от друга. Каждый препарат разделяется в электрическом поле независимо от своих соседей, образуя свой набор зон. Вместо окрашивания или наряду с ним часто используют методы обнаружения разделенных зон по их радиоактивности. К ним относятся приемы регистрации полос на фотопленке посредством авторадиографии или флюорографии и различные способы счета радиоактивности в геле с помощью жидкостных сцинтилляционных счетчиков.
Фракционированием в ПААГ и агарозе не исчерпываются современные методы электрофореза. В качестве «носителей» жидкой фазы широко используют также пленки из ацетата целлюлозы, фильтровальную бумагу, тонкие слои силикагеля, целлюлозы, сефадекса и др. В некоторых случаях, например для разделения низкомолекулярных веществ, эти системы имеют свои преимущества, однако для фракционирования белков, нуклеиновых кислот и их фрагментов в настоящее время используют почти исключительно гель-электрофорез
Важное место в биохимических исследованиях занимает выделение индивидуальных белков из органов и тканей. Очищенные индивидуальные белки нужны для изучения их первичной структуры, получения кристаллов белков с целью исследования их пространственной структуры методом рентгеноструктурного анализа, установления взаимосвязи между первичной, пространственной структурой белка и его функцией.
Некоторые очищенные индивидуальные белки используют в медицине как лекарственные препараты, например гормон инсулин применяют для лечения сахарного диабета, а пищеварительные ферменты поджелудочной железы назначают при нарушении её функций в качестве заместительной терапии. Кроме того, очищенные ферменты часто используют в биохимических исследованиях в качестве химических реактивов для определения веществ в биологических жидкостях.
Большинство методов, используемых для очистки индивидуальных белков, основано на различиях их физико-химических свойств, а также возможности специфично связываться с лигандом.
Получение индивидуальных белков из биологического материала (тканей, органов, клеточных культур) требует проведения последовательных операций, включающих:
- дробление биологического материала и разрушение клеточных мембран;
- фракционирование органелл, содержащих те или иные белки;
- экстракцию белков (перевод их в растворённое состояние);
- разделение смеси белков на индивидуальные белки.
Для разрушения биологического материала используют методы: гомогенизации ткани, метод попеременного замораживания и оттаивания, а также обработку клеток ультразвуком.
Ткань, находящуюся в буферном растворе с определённым значением рН и концентрацией солей, помещают в стеклянный сосуд (гомогенизатор) с пестиком. Вращающийся пестик измельчает и растирает ткань о притёртые стенки сосуда.
В результате попеременного замораживания и оттаивания образующиеся кристаллы льда разрушают оболочки клеток.
После разрушения ткани нерастворимые части осаждают центрифугированием. Последующее центрифугирование гомогената с разной скоростью позволяет получить отдельные фракции, содержащие клеточные ядра, митохондрии и другие органеллы, а также надосадочную жидкость, в которой находятся растворимые белки цитозоля клетки. Искомый белок будет содержаться в одной из этих фракций.
Если искомый белок прочно связан с какими-либо структурами клетки, его необходимо перевести в раствор. Так, для разрушения гидрофобных взаимодействий между белками и липидами мембран в раствор добавляют детергенты; чаще всего используют тритон Х-100 или додецилсульфат натрия.
При действии детергентов обычно разрушаются и гидрофобные взаимодействия между протомерами в олигомерных белках.
Нуклеиновые кислоты, липиды и другие небелковые вещества можно удалить из раствора, используя их Особенные физико-химические свойства. Так, липиды легко удаляются из раствора добавлением органических растворителей, например ацетона. Однако воздействие должно быть кратковременным, так как ацетон вызывает денатурацию некоторых белков. Нуклеиновые кислоты осаждают добавлением в раствор стрептомицина.
Наиболее трудоёмкий этап получения индивидуальных белков — их очистка от других белков, находящихся в растворе, полученном из данной ткани. Часто изучаемый белок присутствует в небольших количествах, составляющих доли процента от всех белков раствора.
Так как белки обладают конформационной лабильностью, при работе с белками следует избегать денатурирующих воздействий, поэтому выделение и очистка белков происходят при низких температурах.
На первых стадиях очистки белков целесообразно использовать методы, учитывающие какую-либо характерную особенность данного белка, например термостабильность или устойчивость в кислых растворах. Первыми методами очистки необходимо удалить из раствора основную массу балластных белков, которые значительно отличаются от выделяемого белка физико-химическими свойствами. Впоследствии применяют всё более тонкие методы очистки белка.
Большинство белков денатурирует и выпадает в осадок уже при кратковременном нагревании раствора до 50-70°С или подкислении раствора до рН 5. Если выделяемый белок выдерживает эти условия, то с помощью избирательной денатурации можно удалить большую часть посторонних белков, отфильтровав выпавшие в осадок-белки, или осадить их центрифугированием.
Метод очистки белков, основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочно-земельных металлов вызывают обратимое осаждение белков, т.е. после их удаления белки вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.
Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония — (NH4)2SO4. Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания.
Для разделения белков часто используют хроматографические методы, основанные на распределении веществ между двумя фазами, одна из которых подвижная, а другая неподвижная. В основу хроматографических методов положены разные принципы: гель-фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства.
Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с «порами», через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной «пор».
Неподвижная фаза — жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают (элюируют), пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы.
Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул .
Так как гелевая структура сефадекса легко деформируется под давлением, гели стали заменять более жёсткими матрицами (сефактил, той-оперл), представляющими сферические гранулы с разными размерами пор. Выбор размеров пор в гранулах зависит от целей хроматографии (о других хроматографических методах будет сказано ниже).
Метод разделения также основан на различии в молекулярных массах белков. Скорость седиментации веществ в процессе вращения в ультрацентрифуге, где центробежное ускорение достигает 100 000-500 000 g, пропорционально их молекулярной массе. На поверхность буферного раствора, помещённого в кювету, наносят тонкий слой смеси белков. Кювету помещают в ротор ультрацентрифуги. При вращении ротора в течение 10-12 ч более крупные молекулы (с большей молекулярной массой) оседают в буферном растворе с большей скоростью. В результате в кювете происходит расслоение смеси белков на отдельные фракции с разной молекулярной массой .После расслоения белковых фракций дно кюветы прокаливают иглой и по каплям собирают содержимое небольшими порциями в пробирки.
Разделение смеси белков методом гель-фильтрации.
Кювета, заполненная буферным раствором с разделёнными белковыми фракциями.
Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки — к катоду (-).
Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам.
Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле выше, чем на бумаге. Так, при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге обнаруживают только 5 главных фракций: альбумины, α1 глобулины, α2-глобулины, β-глобулины и γ-глобулины (рис. 1-57). Электрофорез тех же белков в полиакриламидном геле позволяет получить до 18 различных фракций. Для обнаружения белковых фракций полоски бумаги или столбики геля обрабатывают красителем (чаще всего бромфеноловым синим или амидовым чёрным). Окрашенный комплекс белков с красителем выявляет расположение различных фракций на носителе.
Так же как и электрофорез, метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий.
В качестве неподвижной фазы используют ионообменники — полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы.
Различают положительно заряженные анионообменники, среди которых наиболее часто используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлозу), содержащую катионные группы, и отрицательно заряженные катионообменники, например карбоксиметилцеллюлозу (КМ-цел-люлозу), содержащую анионные группы.
Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательно
Электрофорез белков сыворотки крови здорового человека на бумаге.
заряженного белка используют анионообменник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть (элюировать) буферными растворами с различной концентрацией соли, чаще всего NaCI, и разными значениями рН. Ионы хлора связываются с положительно заряженными функциональными группами анионообменника и вытесняют карбоксильные группы белков. При низких концентрациях соли элюируются белки, слабо связанные с анионообменником. Постепенное увеличение концентрации соли или изменение рН, что меняет заряд белковой молекулы, приводит к выделению белковых фракций, в одной из которых находится искомый белок.
Это наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К ли-ганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом. Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом.
Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз.
Аффинная хроматография.
Для удаления низкомолекулярных соединений, в частности сульфата аммония после высаливания, применяют диализ. Метод основан на том, что через полупроницаемую мембрану, пропускающую низкомолекулярные вещества, не проходят белки, имеющие более высокую молекулярную массу. В стакан большой ёмкости (около 1 л) с буферным раствором помещают полупроницаемый мешочек, заполненный раствором белка с солью.
Скорость выхода соли из мешочка в буферный раствор пропорциональна градиенту его концентраций по обе стороны от мембраны. По мере выхода соли из мешочка буферный раствор в стакане меняют.
Для очистки белков от низкомолекулярных примесей используют также метод гель-фильтрации.
Для определения частоты (гомогенности) выделенного белка применяют методы с высокой разрешающей способностью, например электрофорез в полиакриламидном геле, высокоэффективная хроматография высокого давления. От чистоты лекарственного белкового препарата зависят его биологическая эффективность и аллергенность (т.е. способность вызывать аллергические реакции). Чем качественнее очищен препарат, тем меньше вероятность осложнений при его применении.
Нуклеиновые кислоты — это биополимеры, макромолекулы которых состоят из многократно повторяющихся звеньев — нуклеотидов. Поэтому их называют также полинуклеотидами. Важнейшей характеристикой нуклеиновых кислот является их нуклеотидный состав. В состав нуклеотида — структурного звена нуклеиновых кислот — входят три составные части:
· азотистое основание — пиримидиновое или пуриновое. В нуклеиновых кислотах содержатся основания 4-х разных видов: два из них относятся к классу пуринов и два — к классу пиримидинов. Азот, содержащийся в кольцах, придает молекулам основные свойства.
· моносахарид — рибоза или 2-дезоксирибоза. Сахар, входящий в состав нуклеотида, содержит пять углеродных атомов, т.е. представляет собой пентозу. В зависимости от вида пентозы, присутствующей в нуклеотиде, различают два вида нуклеиновых кислот — рибонуклеиновые кислоты (РНК), которые содержат рибозу, и дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), содержащие дизоксирибозу.
· остаток фосфорной кислоты. Нуклеиновые кислоты являются кислотами потому, что в их молекулах содержится фосфорная кислота. Нуклеотид — фосфорный эфир нуклеозида. В состав нуклеозида входят два компонента: моносахарид (рибоза или дезоксирибоза) и азотистое основание.
Сочетание технологии электрофореза на микрочипе, автоматизированной пробоподготовки и чувствительного флуориметрического детектирования предлагает высокоэффективную замену традиционному агарозному гель-электрофорезу. Качественный и количественный анализ нуклеиновых кислот становится теперь как никогда быстрым, недорогим и высокоточным. В настоящее время при проведении исследований нуклеиновых кислот основным методом изучения распределения фрагментов ДНК и РНК по молекулярной массе (размеру) остается агарозный гель-электрофорез. К основным недостаткам этого метода следует отнести достаточно высокую стоимость анализа при использовании готовых пластин геля, высокую трудоемкость, связанную с большим количеством ручных операций, длительность анализа, необходимость использования дополнительного весьма дорогостоящего оборудования для визуализации и последующей цифровой обработки электрофореграмм, использование небезопасных для здоровья реагентов (бромистого этидия). Всех этих недостатков лишена последняя разработка компании Shimadzu – прибор для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот с использованием микрочипа MCE®-202 MultiNA.
- Низкая стоимость анализа. Конструкция и материал микрочипа позволяют использовать его для нескольких тысяч анализов, при этом используется крайне незначительное количество расходных материалов. Тем самым достигается существенное снижение стоимости (в 1,5 – 3 раза) одного анализа ДНК по сравнению с агарозным гель-электрофорезом. Если сравнивать систему электрофореза на микрочипе с существующими сейчас на рынке системами капиллярного электрофореза, то снижение стоимости анализа может достигать 6 и более раз. В случае анализа РНК экономия может быть еще более существенной (рассчитано, исходя из стоимости оборудования и реагентов на японском рынке).
- Высокая скорость анализа. Высокоскоростной автоматизированный анализ до 108 образцов (96 + 12 дополнительно). С использованием одного микрочипа полный цикл анализа ДНК составляет 255 секунд. Для увеличения производительности в прибор может быть установлено до четырех микрочипов для параллельной работы. В этом случае время одного анализа сокращается до 75 секунд.
- Высокая чувствительность. Флуориметрический детектор с фотоумножителем и источником возбуждения флуоресценции на основе светодиода обеспечивает примерно 10-кратное увеличение чувствительности по сравнению с традиционным окрашиванием бромистым этидием (данные получены в ходе внутренних испытаний в лаборатории Shimadzu). К тому же используемые флуоресцентные красители, такие как SYBR green II и SYBR gold, абсолютно безвредны для здоровья в отличие от бромистого этидия.
- Высокое разрешение и прекрасная воспроизводимость анализа. Оптимальная конфигурация капилляров микрочипа и специально подобранный состав буферного раствора обеспечивают превосходные характеристики электрофоретического разделения нуклеиновых кислот. Благодаря автоматизированной системе пробоподготовки количество ручных операций сведено к минимуму. Внутренние маркеры молекулярного веса уже включены в наборы реагентов и используются при каждом анализе. Все это в комплексе существенно увеличивает надежность и воспроизводимость получаемых результатов. Прибор может комплектоваться четырьмя различными наборами реагентов для анализа ДНК разного размера и РНК
- Простота использования. Программное обеспечение с дружественным пользовательским интерфейсом и большим количеством функций максимально упрощает проведение исследования. Оператору достаточно загрузить образцы и реагенты в прибор, задать в программе желаемую последовательность анализа образцов и кликнуть по иконке «Старт» на экране компьютера. Все остальное, включая обработку электрофореграмм, прибор выполнит в автоматическом режиме.
Микрочип, изготовленный из кварца высокой чистоты, включает микроемкости для загрузки образца и реагентов и электрофоретический канал 23 × 0,09 × 0,05 мм (д ×ш × г). Напряжение подается при помощи напыленных платиновых электродов. Канал и микроемкости выполнены с высочайшей точностью при помощи уникальной фотолитографической технологии Shimadzu. Специальное покрытие обеспечивает возможность многократного использования одного и того же микрочипа (
3600 анализов). Следствием малой длины электрофоретического канала и его оптимальной формы является непревзойденная на сегодняшний день скорость электрофоретического разделения нуклеиновых кислот. Наборы реагентов для анализа ДНК и РНК. Прибор может комплектоваться тремя наборами реагентов для анализа ДНК различного размера и набором реагентов для анализа РНК.
источник