Разделение фрагментов днк при электрофорезе

Для визуализации результатов операций, проводимых с ДНК,таккак выделение, рестрикция,полимеразная цепная реакция(ПЦР),молекулярное клонирование, наиболее частоиспользуютэлектрофорез.

Электрофорез — метод разделения макромолекул (в том числе
молекул и фрагментов ДНК) в геле по размеру и заряду в постоянном электрическом поле. Существует два вида электрофореза: горизонтальный и вертикальный.

Для проведения горизонтального электрофореза используют пластину агарозного геля необходимой концентрации с добавлением специального красителя ДНК, например бромида этидия.

На скорость движения ДНК в геле в процессе электрофореза влияют несколько факторов.

Концентрация агарозы в геле.Агарозный гель — пористая струк-
тура, причем увеличение концентрации агарозы в геле приводит к
уменьшению размеров его пор. Это позволяет при помощи геля с
разной концентрацией агарозы разделять линейные молекулы
ДНКв широком диапазоне их размеров, вплоть до 60 тыс. пар
нуклеотидов (п. н.).

Существует зависимость длины разделяемых фрагментов ДНК
от концентрации агарозы в геле;

Концен- 0,3 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,2 1,5 2,0

Длина 5-60 1-30 1-20 0,8-12 0,6-10 0,5-8 0,5-7 0,4-6 0,2-3 0,1-2

Заряд молекулы.Поскольку каждый из нуклеотидов молекулы
ДНК несет остаток ортофосфорной кислоты со свободной гидроксильной группой, в нейтральной и особенно в слабощелочной
среде молекула ДНК приобретает отрицательный заряд и способность перемещаться в электрическом поле в направлении от катода (отрицательный электрод) к аноду (положительный электрод). Электрофоретическая подвижность молекулы ДНК существенно снижается с увеличением ее длины.

Напряженность электрического поля.На скорость движения заряженных молекул ДНК в геле влияет напряженность электрического поля, определяемая напряжением постоянного электрического поля, подаваемого на электроды. Данные, приведенные на
рисунке 1, свидетельствуют о наличии обратно пропорциональной зависимости между длиной пробега ДНК в геле и напряженностью электрического поля. Число полученных электрофореграмм различно, поэтому разделение фрагментов ДНК для
аналитических целей (только с целью детекции ДНК) с максимальным разрешением рекомендуют проводить при напряжении 10—15 В/см, а для препаративных (если ДНК будет в дальнейшем выделена из геля и использована, например, для клони-
рования) — при

Линейные молекулы ДНК одного размера движутся в геле с
одинаковой скоростью. Однако подвижность суперспирализованных и кольцевых молекул ДНК отличается от подвижности линейных молекул того же размера. Таким образом, методом элект-рофореза можно фракционировать три формы молекул ДНК бактерий:

• суперспирализованную (нативная молекула, стабилизированная белками);

•линейную (расщепленная рестриктазой кольцевая молекула).
Разделение трех типов молекул ДНК в одном геле выглядит следующим образом (по подвижности от катода к аноду):

Кольцевая молекула ДНК
Линейная молекула ДНК
Суперспирализованная молекула ДНК

При постановке электрофореза можно определить размер (молекулярную массу) только линейной ДНК. Для этого в одну из лунок геля наносят стандарт, в качестве которого используют специальные маркеры молекулярной массы (смесь фрагментов ДНК с
известными значениями молекулярных масс).

Для контроля скорости движения ДНК в геле, а также для определения времени окончания процесса электрофореза применяют краску-лидер (специальный краситель, например бромфеноловый синий), которая перемещается в геле, немного опережая макромолекулы ДНК, двигающиеся в процессе электрофореза.

Для визуализации результатов электрофореза используют краситель бромид этидия, который вносят в процессе приготовления геля. Данное вещество встраивается (интеркалирует) в молекулы ДНК плоскими ароматическими группами. После окончания
электрофореза, продолжающегося от 10 мин до 1 ч, гель помещают на светофильтр трансиллюминатора, пропускающего свет в диапазоне 254—400 нм. Краситель начинает флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм), при этом
становится видна ДНК.

Внимание! Используемый в качестве красителя бромид этидия является мутагенным веществом. При работе с ним необходимо использовать резиновые или латексные перчатки.

Методы вертикального и горизонтального электрофореза
принципиально сходны, однако в последнем случае вместо агарозного используют полиакриламидный гель (ПААГ) и процесс электрофореза проходит вертикально. Электрофорез в ПААГ характеризуется высокой разрешающей способностью.

Кроме того,акриламид является токсичным веществом. Приготовить ПААГ
значительно сложнее, чем агарозный гель. В связи с этим в работе
с ДНК преимущественно используют метод горизонтального
электрофореза в агарозном геле.

Цель работы. Ознакомиться с методом горизонтального электрофореза ДНК в агарозном геле.

Оборудование и материалы.1. Прибор для горизонтального электрофореза.
2. Источник постоянного тока. 3. Электрическая плитка или СВЧ-печь. 4. Гельдокументирующая видеосистема. 5. Автоматические дозаторы переменного объема с наконечниками. 6. Колба мерная вместимостью 1 л. 7. Колба коническая
вместимостью 0,5 л. 8. Цилиндр мерный вместимостью 250 мл. 9. Кристаллизатор.
10. Набор реагентов для электрофореза (например, производимый ООО «КОМПАНИЯ «БИОКОМ»)включает: смесь для приготовления электродного буфера;
навеску агарозы; раствор бромида этидия; раствор краски-лидера (бромфеноловый синий). 11. Проба исследуемой плазмидной ДНК. 12. ДНК-маркер молекулярных масс. 13. Перчатки резиновые или латексные неопудренные. 14. Теплоизолирующая рукавица. 15. Вода дистиллированная.

Ходработы.Приготовлениерабочегобуферногораствора для электрофореза. Содержимое пакета «Буфер для электрофореза» полностью переносят в мерную колбу, раство-ряют в 600—800 мл дистиллированной воды (для более быстрого
растворения следует подогреть раствор до 40—45 «С при постоян-
ном помешивании) и доводят объем полученного раствора до 1 л
дистиллированной водой.

Подготовка прибора для электрофореза к работе. Пользуясь встроенными уровнями и винтовыми ножками,
прибор устанавливают строго горизонтально. В рабочую камеру
наливают буфер для электрофореза. Для формирования гелевой
пластины собирают кювету, в нее помещают аппликатор (гребенку) для формирования лунок в толще геля (рис. 2). Регулируемую

высоту аппликатора выставляют таким образом, чтобы расстояние
от дна кюветы до каждого из зубцов составляло 1—2 мм. В зависимости от числа анализируемых проб одновременно можно установить одну, две или три гребенки.

Приготовление агарозного геля. Навеску агарозы,
необходимую для приготовления 1%-ного геля, полностью переносят в коническую стеклянную колбу вместимостью 250—500 мл,
добавляют 150 мл рабочего раствора буфера для электрофореза и
перемешивают. Суспензию агарозы в колбе доводят до кипения в
СВЧ-печи или на электроплитке, периодически помешивая (колбу
держать, только надев на руку теплоизолирующую рукавицу). Продолжают нагревание до тех пор, пока содержимое колбы не станет
совершенно прозрачным (обычно еще 1 мин). Расплав охлаждают
до 55—60 °С, добавляют 10 мкл раствора бромида этидия, перемешивают (работу проводят в латексных или резиновых перчатках) и
наливают на столик для заливки геля (см. описание к прибору для
электрофореза), не допуская образования воздушных пузырьков,
так, чтобы толщина слоя была не менее 5 мм, а зубцы гребенок
были погружены в гель не менее чем на 4 мм. Гель полностью застывает через 15—20 мин. Столик с готовым агарозным гелем и гре-
бенками переносят в камеру для электрофореза, в которую нали-
вают рабочий раствор буфера для электрофореза так, чтобы по-
крыть гелевую пластину слоем в 2—3 мм. Извлекают гребенки из
агарозного геля легким и плавным движением вверх, стараясь не
повредить образовавшиеся лунки.

Проведение электрофореза. В лунки застывшего агарозного геля осторожно вносят по 3 мкл раствора исследуемых образцов ДНК. В соседнюю лунку геля вносят 3 мкл маркера молекулярных масс фрагментов ДНК. В одну или
две (по краям пластины геля) свободные лунки вносят 2—3 мкл
краски-лидера. Закрывают крышку прибора для электрофореза и
подключают его к источнику постоянного тока, строго соблюдая
полярность электродов и учитывая, что движение фрагментов
ДНК происходит в направлении от катода к аноду (от «минуса» к
«плюсу»). На вольтметре источника постоянного тока устанавли-
вают напряжение 120—150 В. В таком режиме процесс электрофо-
реза продолжают около 30 мин, ориентируясь на фронт пробега
краски-лидера (приблизительно на 3 см). По окончании электро-
фореза источник напряжения отключают, снимают крышку при-
бора, пластину агарозного геля осторожно переносят на свето-
фильтр (просмотровый столик) УФ-трансиллюминатора для де-
текции Включают трансиллюми-
натор. Зоны ДНК, окрашенные бромидом этидия, светятся при
УФ-облучении.

Внимание! Во избежание повреждения сетчатки глаз ультрафиолетовым излучением наблюдать зоны ДНК следует только через за-щитное стекло из комплекта трансиллюминатора или защитные (стеклянные) очки. Полученные результаты регистрируют визуально или с использованием гель-документирующей видеосистемы,пользуясь инструкцией к ней.

Контрольные вопросы.1. Какой принцип лежит в основе метода электрофоре-
за? 2. Какая масса агарозы необходима для приготовления 150 мл 2,5%-ного геля?
3. Какой концентрации агарозный гель нужно использовать для разделения мето-
дом электрофореза фрагментов ДНК размером 350 и 150 п.н.? 4. В каком направ-
лении и почему движутся молекулы ДНК при проведении электрофореза? 5. От
каких факторов зависит скорость движения молекул ДНК в агарозном геле в про-
цессе электрофореза? 6. Почему нужно избегать образования в геле пузырьков
воздуха? 7. За счет чего происходит визуализация ДНК в геле? 8. Каким образом
можно контролировать движение молекул ДНК в геле во время электрофореза?
9. На каких этапах проведения электрофореза необходимо работать в перчатках и
почему?

Задания.1. Поместить схему или фотографию электрофореграммы в рабочий журнал, пронумеровать дорожки и сделать подписи к ним. 2. Определить и подписать размеры фрагментов ДНК-маркера (согласно описанию к нему). 3. По электрофореграмме определить электрофоретическую подвижность и рассчитать примерную молекулярную массу исследуемой плазмидной ДНК, используя маркеры молекулярных масс. 4. Определить, какой из ДНК нижеперечисленных плазмид соответствует исследуемая ДНК, если ДНК плазмиды РСЕМ-2Гимеет размер 3000 п.н.ДНК плазмиды рВК322 — 4361,а ДНК плазмидыр РСУ002—8560 п.н.

источник

Что такое клинические исследования и зачем они нужны? Это исследования, в которых принимают участие люди (добровольцы) и в ходе которых учёные выясняют, является ли новый препарат, способ лечения или медицинский прибор более эффективным и безопасным для здоровья человека, чем уже существующие.

Главная цель клинического исследования — найти лучший способ профилактики, диагностики и лечения того или иного заболевания. Проводить клинические исследования необходимо, чтобы развивать медицину, повышать качество жизни людей и чтобы новое лечение стало доступным для каждого человека.

У каждого исследования бывает четыре этапа (фазы):

I фаза — исследователи впервые тестируют препарат или метод лечения с участием небольшой группы людей (20—80 человек). Цель этого этапа — узнать, насколько препарат или способ лечения безопасен, и выявить побочные эффекты. На этом этапе могут участвуют как здоровые люди, так и люди с подходящим заболеванием. Чтобы приступить к I фазе клинического исследования, учёные несколько лет проводили сотни других тестов, в том числе на безопасность, с участием лабораторных животных, чей обмен веществ максимально приближен к человеческому;

II фаза — исследователи назначают препарат или метод лечения большей группе людей (100—300 человек), чтобы определить его эффективность и продолжать изучать безопасность. На этом этапе участвуют люди с подходящим заболеванием;

III фаза — исследователи предоставляют препарат или метод лечения значительным группам людей (1000—3000 человек), чтобы подтвердить его эффективность, сравнить с золотым стандартом (или плацебо) и собрать дополнительную информацию, которая позволит его безопасно использовать. Иногда на этом этапе выявляют другие, редко возникающие побочные эффекты. Здесь также участвуют люди с подходящим заболеванием. Если III фаза проходит успешно, препарат регистрируют в Минздраве и врачи получают возможность назначать его;

IV фаза — исследователи продолжают отслеживать информацию о безопасности, эффективности, побочных эффектах и оптимальном использовании препарата после того, как его зарегистрировали и он стал доступен всем пациентам.

Считается, что наиболее точные результаты дает метод исследования, когда ни врач, ни участник не знают, какой препарат — новый или существующий — принимает пациент. Такое исследование называют «двойным слепым». Так делают, чтобы врачи интуитивно не влияли на распределение пациентов. Если о препарате не знает только участник, исследование называется «простым слепым».

Чтобы провести клиническое исследование (особенно это касается «слепого» исследования), врачи могут использовать такой приём, как рандомизация — случайное распределение участников исследования по группам (новый препарат и существующий или плацебо). Такой метод необходим, что минимизировать субъективность при распределении пациентов. Поэтому обычно эту процедуру проводят с помощью специальной компьютерной программы.

бесплатный доступ к новым методам лечения прежде, чем они начнут широко применяться;
качественный уход, который, как правило, значительно превосходит тот, что доступен в рутинной практике;
участие в развитии медицины и поиске новых эффективных методов лечения, что может оказаться полезным не только для вас, но и для других пациентов, среди которых могут оказаться члены семьи;
иногда врачи продолжают наблюдать и оказывать помощь и после окончания исследования.

новый препарат или метод лечения не всегда лучше, чем уже существующий;
даже если новый препарат или метод лечения эффективен для других участников, он может не подойти лично вам;
новый препарат или метод лечения может иметь неожиданные побочные эффекты.

Главные отличия клинических исследований от некоторых других научных методов: добровольность и безопасность. Люди самостоятельно (в отличие от кроликов) решают вопрос об участии. Каждый потенциальный участник узнаёт о процессе клинического исследования во всех подробностях из информационного листка — документа, который описывает задачи, методологию, процедуры и другие детали исследования. Более того, в любой момент можно отказаться от участия в исследовании, вне зависимости от причин.

Обычно участники клинических исследований защищены лучше, чем обычные пациенты. Побочные эффекты могут проявиться и во время исследования, и во время стандартного лечения. Но в первом случае человек получает дополнительную страховку и, как правило, более качественные процедуры, чем в обычной практике.

Клинические исследования — это далеко не первые тестирования нового препарата или метода лечения. Перед ними идёт этап серьёзных доклинических, лабораторных испытаний. Средства, которые успешно его прошли, то есть показали высокую эффективность и безопасность, идут дальше — на проверку к людям. Но и это не всё.

Сначала компания должна пройти этическую экспертизу и получить разрешение Минздрава РФ на проведение клинических исследований. Комитет по этике — куда входят независимые эксперты — проверяет, соответствует ли протокол исследования этическим нормам, выясняет, достаточно ли защищены участники исследования, оценивает квалификацию врачей, которые будут его проводить. Во время самого исследования состояние здоровья пациентов тщательно контролируют врачи, и если оно ухудшится, человек прекратит своё участие, и ему окажут медицинскую помощь. Несмотря на важность исследований для развития медицины и поиска эффективных средств для лечения заболеваний, для врачей и организаторов состояние и безопасность пациентов — самое важное.

Потому что проверить его эффективность и безопасность по-другому, увы, нельзя. Моделирование и исследования на животных не дают полную информацию: например, препарат может влиять на животное и человека по-разному. Все использующиеся научные методы, доклинические испытания и клинические исследования направлены на то, чтобы выявить самый эффективный и самый безопасный препарат или метод. И почти все лекарства, которыми люди пользуются, особенно в течение последних 20 лет, прошли точно такие же клинические исследования.

Если человек страдает серьёзным, например, онкологическим, заболеванием, он может попасть в группу плацебо только если на момент исследования нет других, уже доказавших свою эффективность препаратов или методов лечения. При этом нет уверенности в том, что новый препарат окажется лучше и безопаснее плацебо.

Согласно Хельсинской декларации, организаторы исследований должны предпринять максимум усилий, чтобы избежать использования плацебо. Несмотря на то что сравнение нового препарата с плацебо считается одним из самых действенных и самых быстрых способов доказать эффективность первого, учёные прибегают к плацебо только в двух случаях, когда: нет другого стандартного препарата или метода лечения с уже доказанной эффективностью; есть научно обоснованные причины применения плацебо. При этом здоровье человека в обеих ситуациях не должно подвергаться риску. И перед стартом клинического исследования каждого участника проинформируют об использовании плацебо.

Обычно оплачивают участие в I фазе исследований — и только здоровым людям. Очевидно, что они не заинтересованы в новом препарате с точки зрения улучшения своего здоровья, поэтому деньги становятся для них неплохой мотивацией. Участие во II и III фазах клинического исследования не оплачивают — так делают, чтобы в этом случае деньги как раз не были мотивацией, чтобы человек смог трезво оценить всю возможную пользу и риски, связанные с участием в клиническом исследовании. Но иногда организаторы клинических исследований покрывают расходы на дорогу.

Если вы решили принять участие в исследовании, обсудите это со своим лечащим врачом. Он может рассказать, как правильно выбрать исследование и на что обратить внимание, или даже подскажет конкретное исследование.

Клинические исследования, одобренные на проведение, можно найти в реестре Минздрава РФ и на международном информационном ресурсе www.clinicaltrials.gov.

Обращайте внимание на международные многоцентровые исследования — это исследования, в ходе которых препарат тестируют не только в России, но и в других странах. Они проводятся в соответствии с международными стандартами и единым для всех протоколом.

После того как вы нашли подходящее клиническое исследование и связались с его организатором, прочитайте информационный листок и не стесняйтесь задавать вопросы. Например, вы можете спросить, какая цель у исследования, кто является спонсором исследования, какие лекарства или приборы будут задействованы, являются ли какие-либо процедуры болезненными, какие есть возможные риски и побочные эффекты, как это испытание повлияет на вашу повседневную жизнь, как долго будет длиться исследование, кто будет следить за вашим состоянием. По ходу общения вы поймёте, сможете ли довериться этим людям.

Если остались вопросы — спрашивайте в комментариях.

источник

Метод электрофореза в геле использует разницу в размере и заряде различных молекул в образце. Образец ДНК или белка, подлежащий разделению, погружают в пористый гель, помещенный в ионную буферную среду. При приложении электрического поля каждая молекула, имеющая разный размер и заряд, будет проходить через гель с разной скоростью.

Пористый гель, используемый в этой технике, действует как молекулярное сито, которое отделяет большие молекулы от более мелких. Меньшие молекулы движутся быстрее по гелю, а более крупные медленнее. Подвижность частиц также определется их индивидуальным электрическим зарядом. Два противоположно заряженных электрода, которые являются частью системы, тянут молекулы к себе на основе их заряда.

Гель, используемый в геле-электрофорезе, обычно изготавливают из материала, называемого агарозой, который представляет собой желатиновое вещество, экстрагированное из водорослей. Этот пористый гель можно использовать для отделения макромолекул разных размеров. Гель погружают в раствор солевого буфера в камеру электрофореза. Трис-борат-ЭДТА (ТВЭ) обычно используется в качестве буфера. Его основная функция — контролировать pH системы. Камера имеет два электрода — один положительный и другой отрицательный — на двух концах.

Образцы, которые необходимо проанализировать, затем загружают в маленькие лунки в геле с помощью пипетки. По завершении загрузки применяется электрический ток 50-150 В. Теперь заряженные молекулы, присутствующие в образце, начинают мигрировать через гель к электродам. Отрицательно заряженные молекулы движутся к положительному электроду, а положительно заряженные молекулы мигрируют к отрицательному электроду.

Скорость, с которой каждая молекула перемещается через гель, называется ее электрофоретической подвижностью и определяется главным образом ее чистым зарядом и размером. Сильно заряженные молекулы движутся быстрее, чем слабо заряженные. Меньшие молекулы работают быстрее, оставляя более крупные. Таким образом, сильный заряд и малый размер увеличивают электрофоретическую подвижность молекулы, а слабый заряд и большие размеры уменьшают подвижность молекулы. Когда все молекулы в образце имеют одинаковый размер, разделение будет основываться исключительно на их размере.

источник

Электрофорез ДНК

Теория электрофореза

Впервые явление электрофореза было открыто П. И. Страховым и Ф. Ф. Рейссом в 1809 году. В начале 70-ых годов было показано, что с помощью гель-электрофореза можно определить длину и чистоту молекул ДНК. Этот метод прост, так как каждый нуклеотид в молекуле нуклеиновой кислоты обладает отрицательным зарядом, который заставляет молекулы двигаться к положительному электроду. Были разработаны специальные полиакриламидные гели, с помощью которых удается разделить фрагменты ДНК длиной до 500 нуклеотидов, отличающиеся даже на один нуклеотид. Поскольку поры в полиакриламидном геле для больших молекул ДНК слишком малы, для их разделения по размеру были разработаны специальные гели на основе агарозы (полисахарид, выделяемый из морских водорослей). Оба эти метода разделения ДНК широко используются для аналитических и препаративных целей.

В 80-ых годах была предложена модификация гель-электрофореза в агарозном геле, названная электрофорезом в пульсирующем электрическом поле или пульс-электрофорез. С ее помощью удается разделять большие молекулы ДНК (от 10 т.п.н. до 10 млн.п.н.), к которым относятся хромосомные ДНК прокариот и низших эукариот. Обычный гельэлектрофорез не позволяет разделить такие молекулы ввиду постоянства электрического поля, которое придает молекулам змеевидную конфигурацию. Обладающие такой конфигурацией молекулы движутся в гелях с постоянной скоростью вне зависимости от длины молекул. Если же направление электрического поля будет часто меняться, скорость движения молекул будет определяться их способностью переориентироваться согласно этому изменению. Такой процесс у больших молекул занимает значительно больше времени, вследствие чего они будут отставать. На гелях после пульс-электрофореза целые хромосомы дрожжей выявляются в виде отдельных полос, и поэтому можно легко определить хромосомные перестройки.

Сейчас электрофорез занимает центральное место среди методов исследования нуклеиновых кислот. Метод позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по таким важнейшим параметрам, как размеры (или молекулярная масса), пространственная конфигурация, вторичная структура и электрический заряд, причем эти параметры могут выступать как порознь, так и в совокупности.

Физический принцип метода заключается в следующем. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от рН среды. Если через этот раствор, заключенный в канал из изолирующего материала начать пропускать электрический ток, то вдоль канала установится определенный градиент напряжения, т. е. сформируется электрическое поле. Его напряженность измеряется разностью потенциалов по концам рабочего канала (или его участка), отнесенной к его длине (В/см). Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода, причем их трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают разные скорости, и в этом – сущность процесса электрофореза. Постепенно исходный препарат, состоявший из различных молекул, разделяется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с одной и той же скоростью. Со временем эти зоны распределяются по длине канала.

В современных приборах рабочий канал заполняют гелем. Достаточно чистая и хорошо смачиваемая (гидрофильная) пространственная сетка геля удерживает жидкость от вытекания и препятствует конвекции. Вместе с тем используемые гели содержат очень много жидкости (80-99,5 %), в которой (т.е. в рабочем буфере) и мигрируют макромолекулы. Наличие сетки геля вносит важную дополнительную деталь в картину электрофоретической миграции. Теперь фракционируемые макромолекулы любых размеров неизбежно сталкиваются с нитями полимера, образующего сетку геля, что увеличивает эффективное трение о среду, а следовательно, снижает скорость движения молекул. Очевидно, что препятствия для миграции становятся особенно серьезными, если средний диаметр пространственных ячеек геля оказывается соизмерим с размерами макромолекул. В этом случае решающее влияние на электрофоретическую подвижность различных макромолекул и степень разделения оказывает соотношение их линейных размеров. Возможна даже такая ситуация, когда особенно крупные молекулы нуклеиновых кислот вообще не смогут «протиснуться» через поры геля и их миграция прекратится.

В настоящее время почти исключительно используются полиакриламидные гели и гели агарозы. Варьируя концентрацию полимера, можно получать гели с очень широким диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрические заряды макромолекул путем вариации рН буфера, а их конфигурацию путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов. Все это придает методу электрофореза исключительную гибкость. Но есть, разумеется, и свои проблемы. Разделяемые макромолекулы все же находятся в растворе, поэтому возможна их диффузия, приводящая к размыванию зон. Это тем более серьезно, что протекание через жидкость электрического тока неизбежно связано с выделением тепла. К счастью, крупные молекулы нуклеиновых кислот диффундируют не слишком быстро.

Для визуализации результатов электрофореза проводят окрашивание зон путем вымачивания геля в растворе красителя, прочно связывающегося с нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют, а гель облучают ультрафиолетом, под действием которого связавшийся с двунитевой ДНК краситель флуоресцирует.

Электрофорез ДНК

Теория электрофореза

Разделение ДНК в агарозном геле

Электрофорез в агарозном геле – стандартный метод, используемый для разделения, идентификации и очистки фрагментов ДНК. С помощью этой простой техники можно быстро разделить такие смеси фрагментов ДНК, которые не могут быть разделены другими способами, например центрифугированием в градиенте плотности. Кроме того, при разделении в геле прямо следят за положением ДНК, так как полосы ДНК в геле можно окрашивать флуоресцирующим и интеркалирующим в ДНК красителем – бромистым этидием в низкой концентрации. Просматривая прокрашенный гель в ультрафиолеотовом свете, можно заметить даже 1 нг ДНК.

Сочетание прочности и крупнопористости делает гели агарозы незаменимыми при электрофорезе особенно крупных макромолекул, в частности нуклеиновых кислот. Агароза – это особо чистая фракция природного линейного полисахарида агара, который извлекают из некоторых видов морских водорослей. Молекулярная масса ее составляет 10 4 –10 5 . Гелеобразование идет, как уже указывалось, путем связывания в пространственную сетку пучков нитей за счет водородных связей между ними. Некоторые виды агарозы образуют прочные гели уже при концентрации 0,3 %.

При температурах от 84 до 96 °С (а у специальных типов – уже при 70 °С) раствор агарозы переходит в прозрачную жидкость – «плавится». Растворы агарозы характеризуются ярко выраженным гистерезисом: они затвердевают, образуя гель, при значительно более низких температурах (36-42 °С). У легкоплавких типов агарозы эта температура снижается до 30°. Такая особенность облегчает манипуляции с расплавленной агарозой – можно не опасаться преждевременного ее застывания в гель. Более того, расплавленную на кипящей бане агарозу предварительно охлаждают до 50-55 °С уже при этой температуре дозируют и заливают в формы; это удобно и не связано с возникновением значительных тепловых деформаций.

Гели агарозы не вполне прозрачны, однако это обусловлено не наличием примесей, а своего рода «кристаллизацией» геля и свидетельствует, скорее, о чистоте агарозы. Затвердевший гель представляет собой не вполне равновесную систему: со временем он несколько уплотняется, выдавливая из себя жидкость. Этот процесс идет вначале довольно быстро, а потом – очень медленно. Тем не менее, гели агарозы перед опытом следует выдерживать в течение, по крайней мере, 12 ч (открытые пластины для горизонтального электрофореза выдерживают во влажной камере). Сжатие сильнее выражено у более концентрированных гелей агарозы.

Агароза для электрофореза выпускается обычно в виде лиофилизированного порошка. Для приготовления геля выбранной концентрации навеску порошка растворяют в соответствующем буфере и выдерживают на кипящей водяной бане или в термостате при 90-95 °С около 2 ч для образования истинного раствора полимера. Иногда раствор агарозы просто кипятят с обратным холодильником.

Разнообразные буферы, детергенты и другие добавки смешивают с раствором агарозы в горячем виде (при 50-60 °С). Впрочем, надо иметь в виду, что высокая концентрация агентов, диссоциирующих водородные связи, несколько затрудняет образование геля.

Плоские гели для горизонтального электрофореза готовят путем заливки дозированного объема расплавленной агарозы на строго горизонтальную пластинку нужного размера.

Выбор концентрации агарозы, т.е. пористости ее геля, диктуется размерами фракционируемых макромолекул. Средний размер пор 2%-ного геля агарозы приблизительно соответствует диаметру сферически упакованной молекулы биополимера с массой 50 млн. дальтон. Гели с более высоким содержанием агарозы используют для гель-фильтрации. При электрофорезе поры геля должны быть легко проницаемы для молекул биополимеров, чтобы лишь тормозить их миграцию в электрическом поле за счет трения, поэтому для электрофореза применяют агарозные гели с концентрацией 0,4–2 %. Ниже в таблице 8 для ориентировки представлены примерные концентрации гелей агарозы (в процентах) для некоторых распространенных образцов фракционирования:

Количество агарозы в геле, %	Объекты
0,4	Высокомолекулярная ДНК вирусов и плазмид
0,7	Рестрикты ДНК (5–20 тыс. н.п)
1,0	мРНК, денатурированная обработкой метилртутью
1,5	Реовирусная двунитевая РНК (500–5000 н.п.)
1,75	Рибосомная РНК
2,0	Нативные мРНК; рестрикты ДНК (100–1000 н.п.)

Перед заливкой в форму или на пластину раствор горячей агарозы охлаждают до 50 °С и выдерживают не менее 1 ч в термостате при данной температуре. Это необходимо для полного выравнивания температуры раствора по всему его объему, чем обеспечивается одновременное застывание всего геля и однородность его структуры.

Гель, полимеризованный на пластинке, помещают на столик открытой поверхностью кверху, поскольку препараты вносят в ряд специальных лунок, образованных опусканием в гель гребёнки и расположенных на некотором расстоянии от его края. Схема прибора для проведения горизонтального электрофореза показана на рисунке 29. Следует быстро вносить препараты в лунки и сразу же начинать электрофорез, так как образцы могут диффундировать в геле.

Рисунок 29 – Электрофорезная ванна, подложка и гребенки для горизонтального электрофореза ДНК в агарозном геле

Скорость миграции ДНК через агарозный гель при электрофорезе определяются пятью главными параметрами, рассмотренными ниже.

Размер молекул ДНК. Молекулы линейной двуцепочечной ДНК перемещаются в геле одним концом вперёд со скоростями, обратно пропорциональными десятичному логарифму их молекулярных масс.

Концентрация агарозы. Фрагменты ДНК данного размера перемещаются в геле, содержащем разные концентрации агарозы, с разными скоростями. Применяя гели разных концентраций, можно разделить большой набор фрагментов ДНК, различающихся по размеру (таблица 10).

Таблица 10 Зависимость разделения линейных молекул ДНК от концентрации агарозного геля

Количество агарозы в геле, %	Область эффективного разделения линейных молекул ДНК, тыс. н.п.
0,3	60–5
0,6	20–1
0,7	10–0,8
0,9	7–0,5
1,2	6–0,4
1,5	4–0,2
2,0	3–0,1

Конформация ДНК. ДНК, имеющие одинаковую молекулярную массу, но разные конформации, например кольцевая неповреждённая (форма I), кольцевая с одноцепочечным разрывом (форма II) и линейная (форма III), движутся в агарозном геле с разными скоростями (рис. 30).Относительная подвижность трёх указанных форм зависит главным образом от концентрации агарозы в геле, а также от таких факторов, как сила тока, ионная сила буфера или плотность сверхспиральных витков в форме I.

I, II, III – конформации плазмидной ДНК (пояснения в тексте).

Рисунок 30 – Изображение электрофоретической подвижности препаратов ДНК: а) высокополимерной линейной ДНК, выделенной из молок лосося (IСN); б) ДНК фага l, расщепленной эндонуклеазой Hind III на линейные фрагменты с фиксированной длиной; в) плазмидной ДНК pUC19

Напряжённость электрического поля. При низких напряжённостях скорость перемещения фрагментов линейной ДНК пропорциональна приложенному напряжению. Однако с увеличением напряжённости электрического поля подвижность фрагментов ДНК с высокой молекулярной массой дифференциально возрастает. Следовательно, с увеличением напряжённости область эффективного разделения ДНК в агарозном геле снижается. Максимальное разделение фрагментов происходит при напряжённости, не превышающей 5 В/см.

Состав оснований и температура. Электрофоретическое поведение ДНК в агарозных гелях (в отличие от поведения в полиакриламидных гелях) слабо зависит от состава оснований ДНК или температуры геля. Обычно электрофорез проводят при комнатной температуре, однако следует отметить, что гели, содержащие менее 0,5 % агарозы, очень мягкие, поэтому с ними лучше работать при 4 ˚С.

Последнее изменение этой страницы: 2017-02-05; Нарушение авторского права страницы

источник

Гель-электрофорез фрагментов ДНК — Для проведения секвенирующего гель-электрофореза фрагментов ДНК, кроме специально изготовленной камеры, которая может быть весьма простой и способной

Возникновение и исчезновение вторичной структуры ДНК

только поддерживать стекла с залитым между ними гелем, даже не обеспечивая при этом отвод выделяющегося в процессе электрофореза тепла, необходим высоковольтный источник питания. Для эффективного разделения в полиакрил амид ном секвенирующем геле фрагментов ДНК подаваемое напряжение должно быть в пределах от 30 до 50 В на см длины геля и, учитывая его большой размер, источник питания должен обеспечивать стабилизацию напряжения не менее 2000 В. Для более эффективного разделения фрагментов ДНК и повышения общей производительности метода можно порекомендовать приобретение фабрично изготовленного прибора, в котором предусмотрено и определенное удобство заливки геля и дальнейшего обращения с ним, и равномерное распределение Джоулева тепла во время электрофореза, и комплект запасных спейсеров и гребешков. Выбор подобных аппаратов, включая автоматические секвенаторы ДНК, достаточно велик, но и их стоимость весьма существенна. Однако следует отметить, что для осуществления небольших проектов секвенирования ДНК не обязательно приобретать дорогостоящие автоматические секвенаторы (хотя в последнее время появились относительно недорогие модели, о которых речь пойдет в главе, посвященной автоматическому секвенированию ДНК).

Успехи в разделении крупных молекул двуцепочечной ДНК с помощью различных вариантов пульс-электрофореза в переменном поле заставили исследователей попытаться применить данный подход и к разделению одноцепочечных фрагментов ДНК в денатурирующем полиакриламидном геле. Так, при электрофоретическом разделении секвенируемых молекул ДНК были применены его наиболее простые варианты, основанные на временном прекращении подачи напряжения, а также реверсии электрического поля [Lai et al., 1989; Birren et al., 1990]. Однако существенного увеличения разрешающей способности секвенирующего гель-электрофореза добиться не удалось при одновременном значительном увеличении его длительности. В то же время математический анализ свидетельствовал о теоретическом уменьшении толщины полос ДНК в таком геле, что должно было привести к их большей четкости и большему числу достоверно «читаемых» полос [Slater, Noolandi, 1988]. Другими авторами был предпринят детальный анализ потенциальных возможностей применения переменных электрических полей для целей секвенирования ДНК [Heller, Beck, 1992]. В результате такого исследования они пришли к выводу, что при определенных условиях можно добиться приемлемого соотношения между временем электрофоретического разделения и его разрешающей способностью. Применение более тонких гелей (0,1 мм против довольно обычных 0,2 мм) показало, что подход с использованием пульс-электрофореза все же позволяет осуществлять «чтение» в области 800-900 нуклеотидов [Noolandi et al., 1993]. Компьютерная реконструкция сканированного изображения радиоавтографа позволила этим авторам продлить границу «чтения» за 1000 нуклеотидов и отдельные индивидуальные основания могли быть «прочитаны» таким способом за пределами 2000 нуклеотидов.

Классической буферной системой для секвенирующего гель-электрофореза является трис-боратный буфер, имеющий рН 8,3 [Махат, Gilbert, 1977; Sanger et al., 1977; Sanger, Coulson, 1978]. Стандартной однократной концентрацией этого буфера считается 89 мМ трис и 8,9 мМ борная кислота, а также 2 мМ ЭДТА. В отдельных случаях используют или половинные, или, наоборот, слегка увеличенные концентрации буферного раствора. Считается, что для разделения фрагментов ДНК большего размера необходимы увеличенная концентрация ЭДТА (до 4 мМ) и более высокий рН (до 8,8). В литературе имеются также сведения об использовании, например, трис-цитратного буфера [Landick et al., 1984]. Было отмечено, что ввиду присутствия в секвенируемых образцах ДНК, приготовленных ферментативным методом, крайне незначительного (но достаточного для нежелательного эффекта) количества глицерина, содержащегося изначально в самом ферментном препарате происходит деформация полос ДНК в верхней части геля, особенно при длительных электрофорезах [Fuller, 1989]. Автор подчеркивает, что причина этого явления не ясна, однако, вероятно, здесь происходит образование сложных эфиров борной кислоты и глицерина, оказывающих заметное воздействие на картину электрофоретического разделения больших фрагментов ДНК в верхней части геля. В дальнейшем было показано, что замена борной кислоты на таурин (β-аминоэтансульфокислота) позволяет преодолеть это негативное явление (Pisa-Williamson, Fuller, 1992]. Секвенирующий диск-электрофорез с использованием для нижней и верхней электрофоретических камер обычного трис-бората, а в качестве гелевого буфера трис-сульфата позволил несколько сократить время электрофоретического разделения при некотором увеличении его разрешающей способности [Carninci et al., 1990].

При электрофоретическом разделении радиоактивно меченной ДНК небольшие фрагменты, а также остатки непрореагировавшей метки могут выходить из геля в нижний буферный резервуар, загрязняя его. С целью освобождения нижнего буфера от радиоактивного загрязнения и превращения его в твердые радиоактивные отходы был предложен способ сорбции радиоактивных нуклеотидов и мелких фрагментов ДНК на анионно-обменной смоле путем колоночной хроматографии [Kaczorowski et al., 1994]. Эффективность данного процесса весьма высока и приближается к 100%, поэтому уже не требуется обращения с отработанным нижним буферным раствором как с жидким радиоактивным отходом и он после такой дезактивации может быть просто слит в раковину.

Уже упоминавшаяся компрессия фрагментов ДНК при их разделении секвенирующим гель-электрофорезом представляет одну из самых серьезных проблем, которая приводит, подчас, к неверному прочтению правильной последовательности отдельных нуклеотидов. Известно, что такая аномальная подвижность определенных фрагментов ДНК вызвана формированием участков со вторичной структурой на 3′-конце новосинтезированного фрагмента ДНК. Если внимательно рассмотреть процесс образования компрессии, то можно видеть, что обычно в ее формировании принимают участие 3-4 нуклеотида (по одной цепи), представляющие собой, как правило, G- и С-основания (рис. 4.4). Причем до какого-то участка ДНК никаких «шпилечных» структур не возникает и фрагмент ДНК имеет нормальную подвижность. Но следующий по размеру фрагмент ДНК, показывающий компрессию, отличается от предыдущего только на один терминальный нуклеотид (дидезо-ксинуклеотид). Проксимальным дезоксинуклеотидом (N — 1) для данного фрагмента является тот же терминальный дидезоксинуклеотид предыдущего фрагмента. Таким образом, добавление только одного очередного нуклеотида приводит к формированию участка вторичной структуры. Дальнейшее увеличение рассматриваемого здесь фрагмента ДНК еще на 1-2 нуклеотида сохраняет за ним сформировавшийся участок вторичной структуры и, как следствие, имеет место компрессия полос ДНК. Однако при присоединении последующих нуклеотидов подобные «шпилечные» структуры теряют свою прочность, исчезает эффект компрессии и фрагмент ДНК приобретает свою обычную подвижность.

Интересное исследование влияния соседних нуклеотидов на подвижность фрагментов ДНК было проведено в связи с проблемой компрессии ДНК [Bowling et al., 1991]. Авторы провели детальное исследование подвижности различных фрагментов ДНК, различающихся своими терминальными, проксимальными (N — 1) и антепроксимальным (N — 2) нуклеотидами. Ими было обнаружено, что если фрагмент ДНК несет на своем 3′-конце ddC, то он будет обладать наибольшей подвижностью и будет максимально приближен к предшествующему ему более короткому фрагменту ДНК, отличающемуся на один нуклеотид. И если у предшествующего фрагмента ДНК этот нуклеотид будет ddT, характеризующийся минимальной подвижностью, то высока вероятность плохого разделения таких фрагментов ДНК. По крайней мере, по данным этих авторов, в диапазоне до 400 нуклеотидов фрагменты ДНК с различными терминальными ддНМФ характеризуются следующей подвижностью:

быстрее ← ddC ← ddA ← ddG ← ddT ← медленнее,

причем пурины обладают весьма близкими величинами подвижности.

В случае, когда dC и dT являются проксимальными нуклеотидами, их влияние на подвижность также весьма заметно и кардинально отличается от приведенного выше для терминальных нуклеотидов. Так, при нахождении в проксимальном положении dT такие фрагменты ДНК будут обладать наибольшей подвижностью, a dC — наоборот:

быстрее ← dT-ddN ← dR-ddN ← dC-ddN ← медленнее.

Для «медленных» dC-ddT олигомеров присутствие антепрокси-мального пурина сделает подвижность таких фрагментов ДНК быстрее по сравнению с пиримидином в этом положении:

быстрее ← dR-dC-ddT ← dR-dC-ddT медленнее.

В результате проведенного исследования авторы цитируемой работы пришли к заключению, что выявленные ими некоторые отличия в подвижности фрагментов ДНК зависят не только от их общей молекулярной массы и заряда, но и от весьма заметного взаимодействия различных нуклеотидов, находящихся на 3′-конце разделяемых гель-электрофорезом фрагментов ДНК.

В первоначальных экспериментах после завершения электрофореза гель во избежание диффузии полос ДНК в замороженном виде экспонировали на рентгеновскую пленку. Однако в этом случае присутствующие в геле вода и мочевина способствовали «гашению» радиоактивных сигналов и полосы ДНК на радиоавтографе получались нечеткими. Введенный впоследствии этап фиксации олигонуклеотидов в геле с помощью 10%-ной уксусной кислоты, кроме перевода нуклеиновых кислот в нерастворимую форму, удалял мочевину. Уже упоминавшийся выше маркерный краситель — бромфеноловый синий — является рН-ин-дикатором и в тех случаях, когда он не успевает выйти и остается в геле, по изменению его окраски с фиолетово-синей на желто-коричневую можно судить об изменении кислотности среды в самом геле. Последующее кратковременное выдерживание фиксированного геля в 10%-ном метаноле или этаноле удаляло следы уксусной кислоты. После удаления избыточной влаги такой гель, завернув в кухонную пленку Saran Wrap, уже можно было экспонировать на рентгеновскую пленку. Однако присутствующая в геле вода затрудняла проведение этапа радиоавтографии. Дальнейшим шагом на пути улучшения качества получаемых сигналов на рентгеновской пленке стало высушивание фиксированных гелей в специальных аппаратах для сушки. Гель после завершения электрофореза и его фиксации переносился вместе с бумагой ЗМ на лист пористого полиэтилена в сушителе гелей. Несмотря на то, что многие приборы обеспечивали высушивание при повышенной температуре, продолжительность этого процесса сильно зависит от вакуумного разрежения, создаваемого различными типами насосов, и в случае использования простого водоструйного насоса весьма значительна. Отрицательным моментом является также то, что немного недосушенный полиакриламидный гель имеет свойство при разгерметизации мгновенно трескаться и съеживаться и спасти такой гель уже не представляется возможным. Разработанный подход все же применялся весьма активно и повлек за собой производство специальных сушителей гелей с рабочей площадью, пригодной для сушки больших секвенирующих гелей. Такие высушенные гели могли экспонироваться на рентгеновскую пленку без опасения их прилипания к желатиновому слою при комнатной температуре без дополнительного слоя пленки Saran Wrap, что приводило к увеличению четкости полос. Немаловажной чертой высушенных гелей, также повышающей разрешение, является, кроме отсутствия самой воды, их меньшая толщина по сравнению с влажными.

Обработка одного из стекол γ-метакрилоксипропилтриметоксисиланом привела к образованию на его поверхности реакционно способных групп. В результате полимеризации полиакриламидного геля он оказывается ковалентно «сшитым» с таким стеклом и при высушивании продолжает оставаться прочно связанным, не меняя свои размеры за исключением толщины [Ansorge, De Maeyer, 1980; Garoff, Ansorge, 1981]. После окончания электрофореза стекла разъединялись и гель, приполимеризованный к одному из стекол, фиксировали в уксусной кислоте и затем после непродолжительного выдерживания в 10%-ном этаноле или метаноле высушивали. Следует отметить, что второе стекло необходимо обрабатывать диметилдихлорсиланом во избежание прилипания геля к нему. При пассивном высушивании при комнатной температуре гель может сохнуть в течение ночи. Для ускорения этого процесса можно применить или фен с теплым воздухом, или поместить стекло с гелем в термостат с температурой не выше 80°С. При использовании клиновидных гелей на этапе фиксации в уксусную кислоту иногда необходимо добавить 2-3% глицерина во избежание растрескивания геля. Метод высушивания полимеризованных на стекле гелей до-вольно прост и удобен, но весьма серьезным недостатком является исключение из обращения стекол на время радиоавтографии. Вторым недостатком является относительно сложное удаление геля со стекла после завершения этапа радиоавтографии. С этой целью стекло с гелем выдерживают в воде и затем влажный гель удаляют каким-либо пластиковым скребком. Другим способом является выдерживание стекла с гелем в растворе 1М гидроокиси натрия до тех пор, пока гель сам не отстанет от стекла.

Предложенный впоследствии метод высушивания геля на стекле, не обработанном γ-метакрилоксипропилтриметоксисиланом, позволяет удалять гель без применения щелочи [Lang, Burger, 1990]. Однако стекло перед полимеризацией геля все же требует травления щелочью и полного исключения контакта с диметилдихлорсиланом. Еще один подход к фиксации и последующему высушиванию геля заключается в использовании специальных Gel-Fix пленок.

источник

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ФРАГМЕНТОВ ДНК. Мост из фильтровальной бумаги Агарозный гель Лунки для образцов ДНК Электрод Буферный раствор Направление движения ДНК Источник. — презентация

Презентация была опубликована 4 года назад пользователемИнга Мячина

Презентация на тему: » ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ФРАГМЕНТОВ ДНК. Мост из фильтровальной бумаги Агарозный гель Лунки для образцов ДНК Электрод Буферный раствор Направление движения ДНК Источник.» — Транскрипт:

1 ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ФРАГМЕНТОВ ДНК

2 Мост из фильтровальной бумаги Агарозный гель Лунки для образцов ДНК Электрод Буферный раствор Направление движения ДНК Источник тока Рис. 1. Схематическое изображение камеры для электрофореза ДНК в агарозном геле. Справа представлена электрофореграмма фрагментов ДНК, окрашенная этидиум бромидом и помещенная под УФ свет. (М – маркеры, 1,2,3 – образцы одной и той же ДНК, разрезанные различными рестриктазами). М 1 2 3Kb

3 1. При помощи набора ферментов рестрикции исследователи научились получать фрагменты ДНК разных размеров практически из любых видов. В ходе манипуляций с различными фрагментами ДНК часто необходимо определить размер или выделить конкретный участок ДНК из смеси. Оказалось, что фрагменты ДНК легче всего разделять с помощью метода электрофореза в агарозном геле. ДНК, обработанную одной или несколькими рестриктазами, помещают в лунки застывшего агарозного геля, который помещается в специальную камеру для электрофореза (рис. 1). В камере создается электрическое поле, под действием которого фрагменты ДНК начинают перемещаться в пористом, похожем на мармелад геле. Скорость продвижения фрагментов ДНК в геле зависит от их длины. Короткие фрагменты движутся быстрее, чем длинные. Это позволяет цепочкам ДНК разной длины отделиться друг от друга. При этом фрагменты ДНК не повреждаются и их можно выделить из геля без всяких повреждений и потери биологических свойств.

4 Если после электрофореза окрасить гель специальным красителем этидиум бромидом, связывающимся с ДНК и поместить гель под ультрафиолетовый свет, то на нем будут хорошо видны окрашенные в красный цвет, расположенные на различном расстоянии друг от друга светящиеся фракции ДНК. Каждая такая фракция соответствует одному фрагменту ДНК. Следует подчеркнуть, что разные рестриктазы дают разную картину расщепления одной и той же ДНК (электрофореграмма на рис. 1 справа). Таким образом, электрофорез в агарозном геле позволяет разделить, а затем легко извлечь любые рестрикционные фрагменты ДНК в чистом виде, для последующего использования. Кроме того, анализируя электрофоретические спектры ДНК на геле, наблюдая за исчезновением одних и появлением других фракций под действием разных рестриктаз, исследователи начали составлять генетические рестрикционные карты расположения участков ДНК для разных видов.

8 ПЦР-АНАЛИЗ И СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК

9 Амплификация фрагментов ДНК с помощью метода ПЦР (полимеразной цепной реакции) Несмотря на то, что методы исследования наследственного материала (нуклеиновых кислот) все время совершенствовались, тем не менее для анализа структуры ДНК требовалось определенное количество клеточного материала. Например, даже при использовании такого чувствительного метода, как фингерпринт, требуется наличие капли крови или другого эквивалентного количества образца животной или растительной ткани, содержащих в клетках достаточное для анализа количество копий ДНК.

10 Ситуация радикально изменилась благодаря появлению метода, который был разработан Кэри Мюллисом. Этот метод получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР) и стал неотъемлемой процедурой, освоенной во всех генно-инженерных лабораториях мира. Использование ПЦР методики позволяет амплифицировать (размножать) ДНК или её фрагмент in vitro увеличивая количество копий в миллионы раз за несколько часов. ПЦР осуществляют в пробирке с помощью специального термостабильного фермента ДНК-полимераза (Tag-полимеразы), набора всех четырех нуклеотидов А, Т, Г и Ц и коротких олиго- нуклеотидных затравок – праймеров. Праймеры – это короткие, длиной в нуклеотидов, одноцепочечные фрагменты ДНК, комплементарные 3-концевым последовательностям копирует- мой ДНК-матрицы. Благодаря праймерам ограничивается фрагмент ДНК, который будет скопирован Tag-ДНК-полимеразой, просо- уединяющейся к 3-концам праймеров и достраивающие их до заданной длины. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) протекает в три стадии (рис).

11 Рис. 1. Последовательные стадии одного цикла амплификации (размножения) фрагмента ДНК с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Денатурация Гибридизация Полимеризация o С 50 o С 70 o С 5 3 t=15c. t=30c. t=90c.

12 1. Денатурация. Инкубационную смесь, в которой содержится образец нужной ДНК, нагревают до температуры 90 С. При этом, в течении 15 секунд происходит разрушение слабых водородных связей между нитями ДНК, и из одной двухцепочечной молекулы образуется две одноцепочечные. 2. Гибридизация праймеров. Температуру снижают до 50 С. При этом происходит гибридизация цепей ДНК с праймерами. Эта стадия обычно протекает Полимеризация. Инкубационную смесь нагревают до температуры 70 С. При этой температуре Tag-полимераза удлиняет оба праймера с их 3-концов. Праймеры дорастают до размеров матрицы. Этот процесс протекает в течении 90 секунд. В результате количество ДНК удваивается. Фер- мент Tag-полимераза была выделена из термофильных бактерий Thermus aquaticus, и отличается устойчивостью к высокой температуре. При температуре 70 С гибрид праймер-ДНК не денатурирует, а Tag-полимераза способна работать с большой скоростью. За 20 циклов амплификации количество копий ДНК достигает величины 106.

13 В последние годы удалось создать специальный прибор — амплификатор, с помощью которого все три стадии размножения ДНК производятся автоматически, что превратило процесс ПЦР-амплификации конкретной последовательности ДНК в простую задачу. За разработку метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в 1993 г. Кэри Мюллис (K. Mullis) был удостоен звания лауреата Нобелевской премии.

14 Секвенирование нуклеотидных последовательностей ДНК Настоящим успехом стала разработка методов секвенирования фрагментов ДНК длиной нуклеотидных пар. Первый прямой метод определения последовательности ДНК был предложен Ф. Сэнгером в 1975 г. Он основан на элонгации ДНК при помощи фермента ДНК-полимеразы. Этим способом бы-ла быстро секвенирование короткая ДНК фага х 174, длиной 5,4 кб. Столь же мощный метод сиквенса ДНК был разработан А. Максамом и У. Гилбертом в 1977 г. в Гарвардском университете. С его помощью менее чем за год удалось установить последователь-ность ДНК для вируса sv-40 (5,2 кб) и плазмиды рBR322 (4,3 кб). Метод секвенирования ДНК по Максамому-Гилберту заключается в следующем. Один из концов фрагмента ДНК, последовательность которого нужно прочитать (секвенировать) метят с помощью 32Р. Препарат меченой ДНК делят на четыре порции и каждую из них обрабатывают реагентом, специфически разрушающим одно из четырех оснований ДНК.

15 Радиоактивная метка Двухцепочечная ДНК Цепи разделяют и получают препарат одной из них Химическим путем разрушают одно из четырех оснований, в результате чего происходит расщепление цепи в соответствующих точках. Условия реакции подбирают таким образом, чтобы в каждой точке расщеплялись только некоторые из цепей; при этом получается набор фрагментов разной длины Радиоавтограф геля Т А Г Ц Последовательность С помощью электрофореза в геле фрагменты разделяются по размеру; те из них. которые содержат радиоактивную метку, оставляют «отпечатки» на рентгеновской пленке. По положению этих отпечатков можно определить, какое именно основание было разрушено при образовании каждого из радиоактивных фрагментов ТАГЦТАГЦ Одноцепочечная ДНК ТТАГАЦЦЦГАТААГЦЦЦГЦАТТАГАЦЦЦГАТААГЦЦЦГЦА Длинные фрагменты Короткие фрагменты

16 Условия реакции подбирают таким образом, чтобы на каждую молекулу ДНК приходилось лишь несколько повреждений. Когда эти повреждённые молекулы обрабатывают пиперидином, в ДНК образуется разрыв в том месте, где находилось разрушенное основание. В результате получается набор меченых фрагментов, длины которых определяются расстоянием от разрушенного основания до конца молекулы. Например, если остатки Г находятся на расстоянии 2, 6, 11 и 16 нуклеотидов от меченого конца, как в случае рассмотренном на рисунке слева, то обработка данной цепи ДНК реагентами, разрушающими Г, приведёт к образованию меченых фрагментов длиной 2, 6, 11 и 16 нуклеотидов (при этом, естественно образуют- ся еще и фрагменты длинной 3 и 4 нуклеотида, но эти фрагменты расположенные между остатками Г будут не меченными). Наборы меченых фрагментов, образующихся при каждой из четырёх реакций подвергают электрофорезу в соседних дорожках полиакриламид него геля, при этом происходит разделение фрагментов ДНК в соответствии с их размерами. Затем проводят радио- автографию геля. Набор полос, регистрируемых на рентгеновской плёнке, «читают», определяя таким образом нуклеотидную последовательность ДНК. Так в примере представленном на рисунке последовательность цепочки ДНК от меченого конца будет следующая АЦГЦЦЦГААТАГЦЦЦАГАТТ.

17 Для анализа последовательностей ДНК на протяжении многих лет широко используется ферментативный метод, разработанный Фрэдом Сэнгером. Этот мощный метод носит название «терминация цепи» и основан на использовании дидезоксинуклеотидов (рис. 1 а). Суть метода заключается в следующем. К одноцепочечной ДНК 3′-5′, которая служит матрицей, добавляется комплементарный радиоактивно меченный праймер 5′-3′ и ДНК-полимераза, которая будет синтезировать комплементарную цепь 5′-3′, последовательно просоединяя нуклеотиды к 3′-ОН группе предыдущих. На первом этапе набор реагентов, содержащий ДНК-матрицу 3′-5′ и праймер, а также ДНК-полимеразу и набор нуклеотидов АТФ, ГТФ, ЦТФ и ТТФ, делится на 4 части и распределяется по пробиркам (рис. 1 б). Кроме того, в пробирки добавляются в небольшом количестве еще и дидезоксинуклеотиды. Причем, в каждую пробирку добавляется только один из четырех.

18 рис. 1 а) и дезоксирибоза; б) набор реагентов для синтеза ДНК в пробирках; в) синтез ДНК в пробирке с добавлением ддТ; г) электрофорез фрагментов ДНК.

19 На рис. 1 в представлен ход реакции синтеза молекулы ДНК в пробирке с добавлением дидезокситимина (ддТ). Синтез новой молекулы ДНК будет останавливаться там, где в цепочку встроится дидезокситимин вместо нормального тимина, так как в дидезокситимине отсутствует группа ОН в 3′ позиции. Поэтому в ряде синтезируемых ДНК репликация прервется в каждой точке, где необходим тимин (рис. 1 в). Аналогичным образом будут протекать реакции синтеза молекулы ДНК 5′-3′ и в остальных трех пробирках. На втором этапе проводится электрофоретическое фракционирование синтезированных фрагментов ДНК из каждой пробирки на четырех дорожках геля. Фрагменты ДНК разделяются в соответствии с их размерами. Чем короче фрагмент ДНК, тем ближе он расположен к нижней границе геля. Анализ спектров на всех четырех дорожках геля позволяет легко установить нуклеотидную последовательность синтези- рованной 5′-3′ цепочки ДНК (рис. 1 г). В нашем примере последователь- ность цепочки ДНК будет следующая 5′-ГААТЦЦГТАТГТ-3′. Соответственно последовательность комплементарной цепочки, используемой в качестве матрицы, будет 3′-ЦТТАГГЦАТАЦА-5′.

20 Рис. 27. Схема радиограммы сиквенса ДНК человека Г Т А Ц На рис. 27 приведена радиоавтография полиакрил- амидного геля, полученного в результате секвенирования по методу Сэнгера небольшого фрагмента ДНК важного гена человека длиной 50 нуклеотидных пар. Исходя из электрофоретического спектра ДНК представленного на радиограмме (рис. 27) можно легко определить нуклеотидную последовательность данного фрагмента уже рассмотренным нами способом. Так, просеквенированный фрагмент ДНК важного гена человека будет иметь следующую последовательность своих 50 нуклеотидов: 5′-ТАТЦАГАТЦТГЦААЦТЦА- ТАТГАТЦГАГАГГГАААТЦААТТЦТГТГААЦГ-3′. Следует отметить, что за разработку методов секвенирования ДНК Ф. Сэнгеру и У.Гилберту в 1980 году была присуждена Нобелевская премия. Интересно, что у Сэнгера это была уже вторая Нобелевская премия. Первую он получил в 1958 году по химии за открытие строения инсулина.

21 Стало ясно, что методы секвенирования нужно как-то автоматизировать. Это сделал в 1986 году Лерой Худ. Он усовершенствовал метод Сэнгера и вместо радиоактивных меток при анализе последовательностей ДНК стал использовать флюорисцентные красители разного цвета для четырех дидезоксинуклеотидов. Флюорисцентный анализ позволил все четыре смеси электрофорезировать вместе, как представлено на рис. 2 б, что дало возможность определять последовательность ДНК автоматически и выводить результат на экран компьютера (рис. 2 в).

22 Рис. 2 а) электрофорез фрагментов ДНК на четырех дорожках геля; б) электрофорез фрагментов ДНК с флюоресцентными красителями на одной дорожке; в) автоматическое прочтение последовательности нуклеотидов ДНК.

23 На этом принципе основана работа современных секвенаторов – приборов для автоматического анализа последовательностей ДНК. С помощью секвенаторов в настоящее время генетики могут «прочитывать» 1000 и более нуклеотидных пар за одну операцию.

источник